[发明专利]一种α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种α‑环糊精葡萄糖基转移酶突变体。本发明通过对野生型α‑环糊精葡萄糖基转移酶进行突变，得到所述α‑环糊精葡萄糖基转移酶突变体，与野生型α‑环糊精葡萄糖基转移酶相比，具有更高的热稳定性，可以在更宽的温度范围内保持较高的活性，且储存稳定性也得到明显提高。本发明所述α‑环糊精葡萄糖基转移酶突变体可以在70‑80℃温度下，保持高稳定性，用于转化淀粉底物制备α‑环糊精，反应过程中无需二次加酶，仍能实现高转化率。

技术领域

本发明涉及酶工程和和微生物工程技术领域，具体涉及一种α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用。

背景技术

环糊精是淀粉在环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称。常见的环糊精有α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，它们分别是由6、7、8个葡萄糖单元组成的环状分子。环糊精具有亲水的外缘和疏水的内腔，能够包埋其它分子，起到促溶、稳定、缓释、乳化和分散等多种作用。其中，α-环糊精(阿尔法环糊精)为环状麦芽六糖，内腔尺寸小，且在水中溶解度高，更适合于包埋小分子，以及要求溶解度较高的应用场合。国际食品添加剂专家委员会(JECFA)安全性评价认为α-环糊精安全性高，没有使用量的限制。α-环糊精在医药、食品、化工等工业领域中都有着广泛的应用。

目前，α-环糊精的生产一般采用以下技术路线：

淀粉底物先用水悬浮得到淀粉悬液，并调节pH至7.0-8.0之间，加热升温至70-80℃糊化后，加入适量的软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)α-环糊精葡萄糖基转移酶(简称α-CGT酶)，在70-80℃温度下进行液化；液化后降温至40-50℃再补充适量的α-CGT酶进行环化反应，环化反应过程中可以加入癸醇等试剂选择性沉淀生成的α-环糊精；最后，过滤收集α-环糊精沉淀物，蒸馏除去癸醇等试剂，再经过活性炭脱色、浓缩结晶得到α-环糊精粗品，在经过精制得到α-环糊精。

然而，上述工艺主要存在以下问题：

首先，由于α-环糊精生产中所用α-环糊精葡萄糖基转移酶热稳定性较低，需要分两次添加酶液分别进行液化和环化。具体为淀粉糊化液中先添加一次α-环糊精葡萄糖基转移酶，在70-80℃温度下进行液化，然后降温至40-50℃再二次补充α-环糊精葡萄糖基转移酶进行环化反应。由于α-环糊精葡萄糖基转移酶热稳定性低，而液化过程中温度较高，导致液化反应后α-环糊精葡萄糖基转移酶几乎完全失活，液化后降温至40-50℃后，如果不添加酶液，后续环化反应难以进行。目前的生产工艺中，需要在降温后二次添加酶液，导致酶液用量大，成本高；此外，二次加酶的同时也会引入更多的杂质，导致转化体系的颜色加深，增加后续工序的脱色及纯化难度。

其次，α-环糊精葡萄糖基转移酶储存稳定性实验结果显示，酶液在室温(25-30℃)条件下放置3个月后，酶活完全丧失。因此，酶液在储存过程中需要加入较多的甘油、明胶等保护剂，并且将酶液置于冷库中保存，才能提高该酶的储存稳定性。但是，保护剂的加入和低温保存，会增加酶液的储存成本；同时，加入大量保护剂的酶液在使用过程中，加酶的同时会把保护剂(甘油、明胶等)带入酶反应体系，导致反应体系中杂质增加，后续纯化难度加大，生产成本增高。

上述缺陷均使得现有的α-环糊精葡萄糖基转移酶无法很好的用于α-环糊精的工业化生产。因此，亟需找到一种高热稳定性的α-环糊精葡萄糖基转移酶。

发明内容

为解决现有技术的问题，本发明提供一种高热稳定性的α-环糊精葡萄糖基转移酶。

为达此目的，本发明第一提供一种α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体，是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶的第298位、第447位、第474位、第498位、第659位、第430位、第451位氨基酸中的一个或多个位点进行突变得到。

进一步优选的，所述突变体为以下a-e中任一或多个组合：