[发明专利]一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法

说明书

本发明涉及水生动物病毒检测技术领域，尤其涉及一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法。本发明利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的试剂盒包括引物和特异性探针，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示；所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明的试剂盒与微滴数字PCR结合使用检测鲈弹状病毒，检测的灵敏度高，不用设置标准曲线，根据检测结果可以直接判读样品中鲈弹状病毒的核酸拷贝数，极大的简化了操作步骤。

技术领域

本发明涉及水生动物病毒检测技术领域，尤其涉及一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法。

背景技术

鲈弹状病毒是危害大口黑鲈、鳜鱼等名优鱼类养殖产业的重大病原之一，它是一种在自然界广泛分布的有囊膜的、单股负链单链RNA病毒，感染宿主广、种类多，能引起多种淡水和海水鱼类出现严重的出血性败血症。通过比对发现，鲈弹状病毒与从乌鳢、鳜鱼、笋壳鱼上分离到的弹状病毒都属于弹状病毒科(Rhabdovirus)，鲈弹状病毒属(Perhabdovirus)。鲈弹状病毒有很高的传染性和致病性，可以通过亲本垂直传播和通过水源、鱼饵、带毒鱼、鱼卵、寄生虫进行水平传播。我们通过流行病学调查发现，鲈弹状病毒主要感染苗种，死亡率可达100％。为了尽早的发现鲈弹状病毒，及时切断病毒的传播，急需建立一种高灵敏度的检测方法。

聚合酶链反应(PCR)、间接酶联免疫吸附实验(间接ELISA)和环介导等温扩增(LAMP)等检测方法灵敏度高、操作简便，但是不能对结果进行定量分析，荧光定量PCR(qPCR)可以做定量分析，但是需要额外的标准品和标准曲线，且对低浓度病毒的定量结果较不稳定，无法在病毒低含量样品实现精准检测。微滴式数字PCR(ddPCR)是20世纪末，Vogelstein等提出的一项核酸定量检测新技术。该方法是对各个反应单元的荧光信号进行判读，根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度。与传统的定量PCR相比，ddPCR可以不需要对照标准样品和标准曲线来实现绝对定量分析，精确度和灵敏度更佳。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法。本发明采用设计的特异性引物和探针与数字PCR结合的方式来检测鲈弹状病毒，将ddPCR技术用于鲈弹状病毒的检测，可以实现快速、准确的对鲈弹状病毒核酸进行绝对定量。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括引物和特异性探针，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示；所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒包括无RNA酶的蒸馏水、一步法ddPCR探针法预混液、探针法ddPCR微滴发生油、质控液、阴性对照和阳性对照。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述一步法ddPCR探针法预混液包括：DNA聚合酶预混液、上游引物、下游引物、特异性探针和无RNA酶蒸馏水。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述一步法ddPCR探针法预混液的总体积为950μL时具体包括：500μL DNA聚合酶预混液、50μL上游引物、50μL下游引物、50μL特异性探针和300μL的无RNA酶蒸馏水。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述阳性对照为含有鲈弹状病毒基因组的质粒；所述阴性对照为无RNA酶蒸馏水。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述引物和特异性探针的浓度均为10μM。

本发明同时提供一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的方法，所述方法为利用所述的试剂盒通过数字PCR技术进行检测。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述检测鲈弹状病毒的方法具体包括以下步骤：