[发明专利]一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物和特异性探针，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括无RNA酶的蒸馏水、一步法ddPCR探针法预混液、探针法ddPCR微滴发生油、质控液、阴性对照和阳性对照。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述一步法ddPCR探针法预混液包括：DNA聚合酶预混液、上游引物、下游引物、特异性探针和无RNA酶蒸馏水。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述一步法ddPCR探针法预混液的总体积为950μL时具体包括：500μL DNA聚合酶预混液、50μL上游引物、50μL下游引物、50μL特异性探针和300μL的无RNA酶蒸馏水。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有鲈弹状病毒基因组的质粒；所述阴性对照为无RNA酶蒸馏水。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物和特异性探针的浓度均为10μM。

7.一种利用数字PCR技术检测鲈弹状病毒的方法，其特征在于，所述方法为利用权利要求1-6任一项所述的试剂盒通过数字PCR技术进行检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述检测鲈弹状病毒的方法具体包括以下步骤：

(1)提取待测样品的总RNA，反转录成cDNA，作为PCR反应模板；

(2)配制ddPCR反应液，体积20μL，其配方为：一步法ddPCR探针法预混液18μL，待测样品cDNA模板为2μL；

(3)制备微滴，按照液滴发生板上标记位置，分别在样品孔和油位孔加入ddPCR反应液20μL和微滴发生油70μL，然后将固定有微滴发生卡的底座置于微滴发生仪中生成微滴；将液滴生成孔中生成的微滴以一一对应的方式全部转入96孔板，用热封仪进行封膜；

(4)将封好膜的96孔板转入PCR仪中进行扩增；

(5)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，使用微滴分析仪检测微滴进行读数，分析每管反应体系中发出荧光的微滴数，显示样品中鲈弹状病毒检测结果。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述扩增的程序为：95℃预变性10min；94℃变性30秒，53-65℃退火60秒，共40个循环；98℃10min，4℃恒温，结束反应，每步都设置2.5℃/秒的降温速度。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述退火的温度为59℃。