[发明专利]一种利用重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法

说明书

本发明提供了一种利用重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法，涉及基因工程技术领域。本发明的方法通过对pPIC9K载体和SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行双酶切、连接，获得天蚕素抗菌肽表达载体；通过将天蚕素抗菌肽表达载体转化至巴斯德毕赤酵母菌并筛选阳性转化子，得到重组巴斯德毕赤酵母；通过对重组巴斯德毕赤酵母进行发酵培养、提取，进而获得天蚕素抗菌肽。本发明的方法能够大量表达天蚕素抗菌肽，特别适合工业化大规模生产；此外，通过该方法生产的天蚕素抗菌肽的抗菌活性高，应用范围广泛。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种利用重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法。

背景技术

天蚕素(cecropins)是第一个被发现的动物抗菌肽，1980年由Boman等从天蚕蛹中分离得到。该类多肽抗生素一般含有37-39个氨基酸残基，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在C端区域可形成疏水螺旋，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，多数多肽的C端被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。

鉴于抗菌肽在杀菌、抗肿瘤甚至抑制病毒复制等方面具有较大的应用潜力，目前国内外正致力于抗菌肽的基因工程等相关研究工作。公开号为CN101307316A的中国专利申请公开了一种以重组枯草杆菌表达系统表达天蚕素CAD抗菌肽的方法，通过人工合成sumo蛋白酶的表达操纵子、酿酒酵母小分子泛素样蛋白与天蚕素AD的融合蛋白表达操纵子基因，克隆天蚕素AD母体基因枯草杆菌表达载体pNF11，转化重组表达载体pNF11-CAD，从而使重组枯草杆菌在摇瓶中诱导表达。

黄亚东等人报道了一种采用PCR技术改造抗菌肽AD基因的方法，将其C末端改造为Asn编码，改造后的抗菌肽Cecropin AD基因克隆到pPICZ-A载体上，构建成酵母重组分泌型表达载体，转化巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris受体菌GS115中，采用zerocin抗性标记筛选重组转化子，经摇瓶发酵，浓缩发酵液进行酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和抑菌活性检测。结果表明，改造后的Cecropin AD基因在巴斯德毕赤酵母中获得了表达。

然而，上述方法仍存在表达量低、抗菌肽抗菌活性有限等缺陷。鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法，该方法方法能够大量表达天蚕素抗菌肽，特别适合工业化大规模生产；此外，通过该方法生产的天蚕素抗菌肽的抗菌活性高，应用范围广泛。

本发明提供一种天蚕素抗菌肽表达载体的构建方法，包括：对pPIC9K载体和SEQID NO：1所示的核苷酸序列进行双酶切、连接，获得天蚕素抗菌肽表达载体。

具体地，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列如下：5’-agatctcacaaaaaaagtgaggatttttttatttttgtattgacaaaaatgggctcgtgtggtataataaatgtagtgaggtg gatgcgagctccagacaaaggaggaaaacatatgattcagaaacggaaacggacggtcagctttagattggtgttaatgt gcacgctgttatttgttagcctgcctatcacgaaaacgtctgct-3’(SEQ ID NO：1)。

本发明对天蚕素抗菌肽基因进行如上改造；结果表明，其能够在巴斯德毕赤酵母中大量表达，且表达的天蚕素抗菌肽的抗菌活性高。

本发明还提供一种天蚕素抗菌肽表达载体，通过上述构建方法构建得到。

本发明还提供一种重组巴斯德毕赤酵母，含有上述天蚕素抗菌肽表达载体。具体地，该重组巴斯德毕赤酵母是通过将天蚕素抗菌肽表达载体转化至巴斯德毕赤酵母菌并筛选阳性转化子得到的。