[发明专利]一种利用重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法

权利要求书

1.一种天蚕素抗菌肽表达载体的构建方法，其特征在于包括：对pPIC9K载体和SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列进行双酶切、连接，获得天蚕素抗菌肽表达载体；

具体地，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列如下：

5’-agatctcacaaaaaaagtgaggatttttttatttttgtattgacaaaaatgggctcgtgtggtataataaatgtagtgaggtggatgcgagctccagacaaaggaggaaaacatatgattcagaaacggaaacggacggtcagctttagattggtgttaatgtgcacgctgttatttgttagcctgcctatcacgaaaacgtctgct-3’(SEQ ID NO：1)。

2.一种重组巴斯德毕赤酵母Y20210415，保藏编号为CGMCC No.22264，建议的分类命名：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。

3.利用权利要求2所述的重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法，其特征在按照下述步骤进行：

1)种子培养：通过种子培养基对重组巴斯德毕赤酵母进行扩大培养；其中，种子培养基的组成为：磷酸二氢钾10.0-12.0g/L、磷酸氢二钾2.0-2.5g/L、七水硫酸镁9.0-10.0g/L、硫酸铵10.0-11.0g/L、氯化钙0.30-0.35g/L、氯化钠0.8-1.2g/L、氯化钾0.8-1.2g/L、葡萄糖25-35g/L、维生素溶液0.8-1.2mL/L、微量元素溶液4.0-4.5mL/L；pH为6.0-6.2；

2)发酵培养：对重组巴斯德毕赤酵母进行发酵培养，获得天蚕素抗菌肽；

采用发酵培养基进行所述发酵培养；其中，发酵培养基的组成为：葡萄糖25-35g/L、硫酸钙0.8-1.0g/L、硫酸钾16.0-17.5g/L、七水硫酸镁16.0-18.0g/L、氢氧化钾4.0-4.5g/L、浓磷酸25.0-28.0mL/L、生物素0.6-1.2mg/L、泛酸钙18-22mg/L、维生素B1 14-16mg/L、肌醇15-17mg/L、烟酸9-11mg/L和维生素B6 3-5mg/L和微量元素溶液4.0-5.0mL/L；

3)表达产物的分离纯化：通过常规方法分离纯化即可获得天蚕素抗菌肽。

4.根据权利要求3所述的重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法，其特征在于所述微量元素溶液的组成为：五水硫酸铜5.0-6.0g/L、碘化钠0.08-0.10g/L、硫酸锰3.0-3.5g/L、钼酸钠0.2-0.4g/L、硼酸0.02-0.05g/L、氯化钴0.5-0.6g/L、氯化锌20-22g/L和七水硫酸亚铁65-70g/L。

5.根据权利要求3所述的重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法，其特征在于所述发酵培养过程中进行补料，补料方法包括：待发酵培养液的溶氧量开始上升时流加葡萄糖溶液，葡萄糖溶液的流加量为0.15-0.20L/L发酵培养基，流加时间为12-16h，溶氧量为15-25％；其中，葡萄糖溶液的组成为：葡萄糖450-550g/L、维生素溶液3-5mL/L、微量元素溶液10-15mL/L。

6.根据权利要求3所述的重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法，其特征在于补料方法还包括：待溶氧量为80-85％时流加氮源，氮源的流加量为0.15-0.20L/L发酵培养基，流加时间为40-60min；其中，所述氮源包括0.1-0.2kg/L的蛋白胨和0.05-0.1kg/L的酵母粉。

7.根据权利要求3所述的重组巴斯德毕赤酵母生产天蚕素抗菌肽的方法，其特征在于，补料方法还包括：在流加氮源后同时流加甲醇、微量元素溶液和维生素溶液，甲醇和微量元素溶液的流加速度为7000-7500mL/h，维生素溶液的流加速度为90-95mL/h，流加时间为55-60h，溶氧量为15-25％；其中，所述维生素溶液的组成为：生物素0.7-0.9g/L、泛酸钙18-22g/L、维生素B1 14-16g/L、肌醇15-17g/L、烟酸9-11g/L和维生素B6 3-5g/L。