[发明专利]一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法

说明书

本发明公开了一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，包括以下步骤:S1：获取待测血液样本，并提取DNA模板；S2：利用引物及探针的组合进行实时荧光RPA检测，根据扩增的结果判断生物样品是否感染拟态弧菌；其中引物和探针以拟态弧菌中相关的毒力因子vmhA基因为靶点进行设计。本发明具有极高的特异性和灵敏度，在较高浓度下(3.5×10⁶cfu/mL)实时荧光RPA法可以在最短3.32min获得阳性结果。本发明实时荧光RPA方法对血浆样本中的抑制成分具有很好的耐受性，可以对简单的煮沸法处理的临床血浆样本进行直接扩增，缩短了整个检测时间。另外，本发明实时RPA方法可以和便携式设备相结合，在拟态弧菌暴发现场的临床诊断中，将是监测拟态弧菌感染的一种非常有用的方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法。

背景技术

拟态弧菌(Vibrio mimicus)作为弧菌属中的主要致病菌之一，广泛分布于包括淡水、海水等自然环境中以及与之接触的野生或养殖水生动物体内，常常导致人和水生动物的患病。因其形态、生理生化特征、患病的临床变现以及基因组特性均与霍乱弧菌(Vibriocholera)极为相似，早期曾被认为是同一种病原菌。在快速扩增繁殖过程，拟态弧菌能产生包括溶血素、肠毒素、包外金属蛋白酶在内的多种毒力因子。因此，人们在食用被拟态弧菌感染的水产品后往往会引起细菌性肠炎，导致急性霍乱样腹泻(cholera-like diarrhea)或痢疾样腹泻(dysentery-like diarrhea)，严重的情况下会导致死亡。近年来，拟态弧菌引起的食物中毒事件在全世界时有发生。我国多地也曾出现过因拟态弧菌感染引起的食物中毒事件。在这些拟态弧菌临床感染病例中，研究者已多次分离出一种与霍乱弧菌产生的霍乱毒素(CT)具有相同的免疫生物学反应的不耐热肠毒素，而且近期有报道称，从我国的淡水鲶鱼中分离到一株毒性更强，传染性更高的拟态弧菌，这表明该菌随着地域环境的变化，其致病性有突变增强的趋势。虽然与拟态弧菌相关的疾病暴发通常是零星的，但目前绝对有必要重新考虑该菌在人与环境中的感染的风险。早期和快速诊断是管理和预防拟态弧菌感染的关键。因此，需尽快建立病原菌的快速、简便、灵敏的检测方法，实现对该病原菌在临床特别是在设备相对落后的基层社区医院的快速检测，这对于提升我们的公共卫生安全保障能力，提高弧菌感染性疾病应急响应水平有着极为重要的意义。

目前，对于拟态弧菌的检测，传统的生理生化实验并结合显微镜观察，仍然是金标准。但该方法繁琐、耗时且往往需要实验人员具备丰富的个人经验。同时由于拟态弧菌在形态和多种生化指标上与霍乱弧菌极为相似，常常导致误判。随着生物技术的不断发展，一些科研人员成功将PCR技术应用于拟态弧菌的检测和分析。但由于PCR技术本身固有的缺点，如需要整套的用于核实扩增检测的仪器设备、一定的实验条件以及操作程序复杂等，大大限制了其在拟态弧菌的实际诊断检测(尤其是快速的基层现场诊断检测)中的应用。近年来，等温核酸扩增技术出现突破了原有PCR扩增的温控条件，降低了核酸扩增对于设备的要求，因此得到了迅速的发展。这其中重组酶聚合酶介导核酸扩增技术(RPA)因其在反应条件及时间的优势格外引人关注。

发明内容

本发明为了克服现有技术的不足，建立一种基于实时RPA的以拟态弧菌中相关的毒力因子vmhA基因为靶点的拟态弧菌快速检测方法。在此基础上，对实时RPA法进行了优化，并通过对人工感染的血液样品的检测评价了该方法在实际应用中的重现性和稳定性。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，包括以下步骤:

S1：获取待测血液样本，并提取DNA模板；

S2：利用引物及探针的组合进行实时荧光RPA检测，根据扩增的结果判断生物样品是否感染拟态弧菌；其中引物和探针以拟态弧菌中相关的毒力因子vmhA基因为靶点进行设计。