[发明专利]一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法

权利要求书

1.一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于,包括以下步骤:

S1：获取待测血液样本，并提取DNA模板；

S2：利用引物及探针的组合进行实时荧光RPA检测，根据扩增的结果判断生物样品是否感染拟态弧菌；其中引物和探针以拟态弧菌中相关的毒力因子vmhA基因为靶点进行设计。

2.根据权利要求1所述的一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于，所述S2中的引物包括vmhR-F1和vmhR-R1，其中，从5’至3’方向，所述vmhR-F1的序列为TAACCCAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA，所述vmhR-R1的序列ATGCTACCGCCCGTACCACCAACCAACAACTC。

3.根据权利要求1所述的一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于，所述S2中的引物包括vmhR-F2和vmhR-R2，其中，从5’至3’方向，所述vmhR-F2的序列为AACCCAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA，所述vmhR-R2的序列为ACCGCCCGTACCACCAACCAACAATC。

4.根据权利要求1所述的一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于，所述S2中的引物包括vmhR-F3和vmhR-R3，其中，从5’至3’方向，所述vmhR-F3的序列为AACCCAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA，所述vmhR-R3的序列为GCTACCGCCCGTACCACCAACCAACAACTC。

5.根据权利要求1所述的一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于，从5’至3’方向，所述S2中探针的序列为CAACTCTACGTACGTGCAGGTGCCGCCA[FAM-dT]^aT[THF]^bA[BHQ-dT]^dGCTTTAGGAACTG(C3-spacer)^d，其中FAM-dT为6羧基荧光素标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸，THF为四氢呋喃间隔，BHQ1-dT为淬灭基团，C3-spacer为C3间隔臂修饰的阻断基团。

6.根据权利要求1所述的一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于，所述S2中引物和探针设计的具体步骤为：

S21：获取拟态弧菌vmhA基因序列；

S22：通过在线比对软件进行同源性比对，寻找同源性保守区域，确定扩增的目标基因序列；

S23：根据TwistAmp DNA扩增实验设计手册设计针对保守区域的引物和探针。

7.根据权利要求1所述的一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于，所述实时荧光RPA的反应体系包括：14.75μL缓冲液、3.6μL去离子水、上下游引物各1.05μL、1.25μl Mg²⁺、0.3μL探针及3μLDNA模板，其中上下游引物的浓度分别为10μM，探针的浓度为10μM。

8.根据权利要求1所述的一种在临床血液样本中快速检测拟态弧菌的方法，其特征在于，所述S1中提取DNA模板的方法为试剂盒提取法或煮沸法。