[发明专利]一种产胍基乙酸的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一种产胍基乙酸的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，属于枯草芽孢杆菌代谢工程和基因工程技术领域。本发明得到的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是由野生型枯草芽孢杆菌为出发菌株，通过在枯草基因组上引入外源的精氨酸：甘氨酸脒基转移酶而得到的一株高产胍基乙酸的重组菌株，其产量达到12.8g/L，第一次实现在枯草芽孢杆菌中进行胍基乙酸的合成。这为枯草芽孢杆菌代谢工程高效生产胍基乙酸奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种产胍基乙酸的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，属于枯草芽孢杆菌代谢工程和基因工程技术领域。

背景技术

胍基乙酸(Guanidinoacetate，GAA)又名胍乙酸，乙酸胍，是一种天然存在的氨基酸衍生物。目前胍基乙酸作为一种饲料添加剂被广泛用于动物生产中，以提高肌肉的产量。目前胍类化合物的合成以化学合成为主，化学工艺大多存在路线复杂，对环境不友好的问题，因此研究开发一种通过微生物合成法合成的对环境无污染且又经济的胍类药物合成工艺具有重要的意义。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在工业上应用十分广泛，在生产蛋白和高附加值化合物的生产上具有非常重要的地位。同时，它是一种非致病微生物，已经被美国食品和药物管理局(FDA)认可为安全的(GRAS)食品级微生物。此外，枯草芽孢杆菌具有许多优点，包括：细胞生长速率快，发酵培养时间短，培养条件要求低，易于进行代谢工程改造，分泌蛋白质能力强等。

改变遗传元器件的表达强度可以达到优化代谢途径的目的，进而实现目的产物的高效合成。通过启动子调控关键基因的表达强度是控制碳通量流向目的产物合成途径的一种常见且较为重要的调控策略。目前已有在大肠杆菌中尝试表达生产GAA，大肠杆菌属于致病性菌株，会产生内毒素，不适用于作为食品添加剂或饲料添加剂。枯草芽孢杆菌相较于大肠杆菌更加适于GAA的生产，但是由于其本身不含有生产GAA的通路，给使用枯草芽孢杆菌生产GAA 带来了一定的困难。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种产胍基乙酸的重组枯草芽孢杆菌菌株及其构建方法。使用可提高或降低蛋白表达量的不同强度的启动子，来启动异源的甘氨酸脒基转移酶 AGAT，将GAA生物合成途径中关键基因agat插入原有的核苷酸序列之前而实现的目的基因表达量的上调或下调，最终实现胞内代谢流的改变而提高GAA的产量。

本发明提供了重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌表达来源于Amycolatopsis kentuckyensis的甘氨酸脒基转移酶AGAT，并敲除基因组中的gcvP和/或argI基因。

在一种实施方式中，所述argI基因为精氨酸分解途径中的第一个基因，甘氨酸分解途径中的第一个基因gcvP。

在一种实施方式中，编码所述甘氨酸脒基转移酶AGAT的基因的核苷酸序列如SEQID NO.12所示。

在一种实施方式中，利用不同强度的启动子表达所述甘氨酸脒基转移酶AGAT；所述不同强度的启动子包括P_xpac、P_ycec、P_lytR、P_sdhB、P₄₃、P_odhA、P₃₃₃、P_yvyD、P_veg或P₅₆₆。

在一种实施方式中，所述启动子P_xpac、P_ycec、P_lytR、P_sdhB、P₄₃、P_odhA、P₃₃₃、P_yvyD、P_veg、P₅₆₆的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～10所示。