[发明专利]一种克拉酸高产菌株构建方法和应用

说明书

本发明涉及代谢工程技术领域，具体来说是一种克拉酸高产菌株及其构建方法和应用。所述构建方法包括：S1、将能够生产克拉酸的大肠杆菌菌株，使用CRISPR/Cas9系统分别将用于对UDP‑葡萄糖途径强化的galu基因片段、用于对UDP‑半乳糖途径强化的gale基因片段以及用于对GDP‑岩藻糖途径强化的gmd、manc和manb的基因片段，依次构建在同一个能够生产克拉酸的大肠杆菌菌株内；S2、选取步骤S1中克拉酸产量最高的菌株，通过克拉酸调控机制强化克拉酸基因簇的转录，获取调控基因在所述菌株内排列组合，进一步提升克拉酸产量。本发明提供的克拉酸高产菌株，产量可达到13.2g/L，具有产量高，发酵时间短，发酵条件不易受限的优势，提供了一种低成本的克拉酸制造方法。

技术领域

本发明涉及代谢工程技术领域，具体来说是一种克拉酸高产菌株及其构建方法和应用。

背景技术

随着医疗技术的发展，人类的平均寿命普遍延长，但随之带来的是人口老龄化的日益严重。因此，如何延缓人体衰老成为了国际上的研究热点之一。近期研究结果表明，肠道微生物能够分泌多种化合物来参与宿主的生理代谢，从而影响着宿主的健康。王萌教授团队近期发现，人体肠道内的大肠杆菌能够分泌某种化合物，延缓宿主细胞线粒体的破裂以及衰老，从而影响宿主的寿命。经过鉴定，此化合物为克拉酸（colanic acid），进一步通过饲喂秀丽隐杆线虫克拉酸，发现延长了其寿命30%，证明克拉酸在功能营养品和健康领域具有广泛的应用前景。

克拉酸，又称M抗原，是一种胞外阴离子杂多糖。于1936年首次被发现，纯化后的克拉酸呈现白色纤维状。Sutherland等通过红外光谱，酶解和甲基化等反应对其结构进行了解析，目前，国内外针对克拉酸的研究，主要集中于研究克拉酸在微生物中的代谢与调控途径，并发现克拉酸的合成往往需要外界极端环境的刺激且产量较低，例如低温、高盐、低PH、干燥以及洗涤剂等，因此通常认为克拉酸与菌株的抗逆性能有关。然而这种极端的合成途径，难以满足克拉酸大量生产的需求。因此，需要对微生物中克拉酸的代谢与调控途径进行改造，使微生物能够在常规的发酵条件下高效生产克拉酸。目前，克拉酸合成的调控机制已经相对清晰，因此可以使用代谢工程与基因工程的手段改变微生物中原有的克拉酸合成调控网络，从而实现克拉酸高效合成的目的。

目前国内外基于克拉酸代谢与合成调控机制构建了一些生产克拉酸的菌株。2020年，Han，Hyeong Min等人以大肠杆菌BL21（△waaf）为出发菌株，以M9为初始培养基，通过发酵优化的方式，将克拉酸产量提高到1.91 g/L，但其克拉酸产量仍然较低，不适合工业化大规模生产。2019年，Chenhui Wang等人通过改造大肠杆菌体内多羟基丁酸途径构建了一株克拉酸高产菌株，通过控制PH进行发酵优化并在发酵罐上发酵，克拉酸产量为10.58 g/L，但Chenhui Wang等人所构建的克拉酸高产菌株发酵需要维持低PH环境，对与菌株发酵相关的自动化控制系统要求较高。

发明内容

为了实现上述目的，设计一种克拉酸高产菌株的构建方法，包括以下步骤：

S1、将能够生产克拉酸的大肠杆菌菌株，使用CRISPR/Cas9系统分别将用于对UDP-葡萄糖途径强化的galu基因片段、用于对UDP-半乳糖途径强化的gale基因片段以及用于对GDP-岩藻糖途径强化的gmd、manc和manb的基因片段，依次构建在同一个能够生产克拉酸的大肠杆菌菌株内；

S2、选取步骤S1中克拉酸产量最高的菌株，通过克拉酸调控机制强化克拉酸基因簇的转录，获取调控基因在所述菌株内排列组合，进一步提升克拉酸产量。

进一步的，所述步骤S1之前，还包括以下步骤：

S0、通过薄层层析技术和离子液相色谱，验证筛选出能够生产克拉酸的大肠杆菌菌株。

在某些实施方式中，所述步骤S1包括以下步骤：