[发明专利]一种克拉酸高产菌株构建方法和应用

权利要求书

1.一种克拉酸高产菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、以保藏编号ATCC25404的大肠杆菌K12 MG1655为初始菌株，将如SEQ ID NO .67所示对UDP-葡萄糖途径强化的galu基因片段整合进入所述初始菌株中，获得大肠杆菌菌1；

S2、在所述大肠杆菌菌1的基因组中，将如SEQ ID NO .68所示对UDP-半乳糖途径强化的gale基因片段整合入flgg位点构建成大肠杆菌菌2；

S3、在所述大肠杆菌菌2的基因组中，将如SEQ ID NO .69所示对GDP-岩藻糖途径强化的gmd基因片段、如SEQ ID NO .70所示对GDP-岩藻糖途径强化的manc基因片段和如SEQ IDNO .71所示对GDP-岩藻糖途径强化的manb基因片段分别整合入基因组中的flga位点、flit位点、flir位点，获得含有如SEQ ID NO .69所示的gmd基因片段的大肠杆菌菌3、含有如SEQID NO .69 所示的gmd基因片段和如SEQ ID NO .70所示的manc基因片段的大肠杆菌菌4、含有如SEQ ID NO .69 所示的gmd基因片段、如SEQ ID NO .70 所示的manc基因片段和如SEQ ID NO .71所示的manb基因片段的大肠杆菌菌5；

S4、在所述大肠杆菌菌5基因组中，将如SEQ ID NO .72所示的rcsa基因整合入基因组中的mota位点，获得大肠杆菌菌6；

S5、在所述大肠杆菌菌6基因组中，敲除如SEQ ID NO .73所示的lon基因片段，获得大肠杆菌菌7，并在所述大肠杆菌菌7基因组的基础上敲除如SEQ ID NO .74所示的hns基因片段，获得大肠杆菌菌8，即所述克拉酸高产菌株。

2.一种采用如权利要求1所述的克拉酸高产菌株的构建方法构建的克拉酸高产菌株制备克拉酸的方法，其特征在于，包括将所述克拉酸高产菌株的菌落挑取至TB培养基中，37℃发酵培养12小时作为种子液，向含有TB培养液的发酵罐中加入种子液，将种子液搅拌通气，添加葡萄糖，发酵温度为20℃~42℃，培养32~60小时后，收集分泌物。

3.如权利要求2所述的制备克拉酸的方法，其特征在于，在所述发酵罐中，发酵温度为42℃，培养时间为32小时。