[发明专利]用于核酸组装和高通量测序的方法

说明书

本发明的一些方面的方法和设备涉及高保真多核苷酸的合成。具体而言，本发明的各方面涉及同时进行酶促去除扩增序列和将经加工的寡核苷酸连接成核酸组装体。根据一些实施方式，该方法包括提供多个寡核苷酸的步骤，其中各寡核苷酸包含(i)与目标核酸序列的不同部分相同的内部序列，(ii)该内部序列5’端之侧的5’序列和在该内部序列3’端之侧的3’侧接序列，各所述侧接序列包含引物对的引物识别位点和限制性酶识别位点。

相关申请

本申请是申请号为201380040527.0的中国发明专利申请(其申请日为2013年6月24日，发明名称为“用于核酸组装和高通量测序的方法”)的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2013/047370的中国国家阶段申请，该申请要求2012年6月25日提交的美国临时专利申请号61/664,118和2012年11月30日提交的美国临时专利申请号61/731,627的权益和优先权，上述各申请通过引用全文纳入本文。

技术领域

本文提供了涉及合成和组装有预定序列的高保真核酸和核酸库的方法和设备。更具体的，提供了用于多核苷酸合成、错误降低和/或高通量测序验证的方法和设备。

发明背景

使用重组DNA化学技术，从自然中复制和扩增DNA序列并随后分解成组成部分是常见的。作为组成部分，随后序列重组或重新组装成新的DNA序列。然而，对天然可得序列的依赖性严重限制了研究者探索的可能性。虽然现在可以从单个核苷直接合成短DNA序列，但通常直接构建多核苷酸的大片段或组件(即长于约400碱基对的多核苷酸序列)是不可行的。

能通过微芯片上的大规模平行定制合成进行寡核苷酸合成(Zhou等，(2004)Nucleic Acids Res.32:5409；Fodor等(1991)Science 251:767)。然而，当前微芯片的表面积非常小，并且因而仅能生成少量的寡核苷酸。在释放到溶液中时，寡核苷酸以每条序列皮摩尔或更低浓度存在，该浓度不足以有效驱动双分子活化反应。无法对目前用于组装少量变体核酸的方法以成本节约的方式进行放大以生成大量特定的变体。同样，仍然需要用于高保真基因组装等的改良的方法和装置。

此外，通常通过化学反应合成微芯片上的寡核苷酸。错误的化学反应导致寡核苷酸中随机的碱基错误。化学核酸合成中关键限制因素之一是错误率。化学合成的寡核苷酸的错误率(例如每100个碱基中1个的缺失和约每400个碱基中1个的错配和插入)超过了通过酶的方式复制现有核酸(例如PCR)所得的错误率。因此，迫切需要一种新的技术来以成本节约的方式生产高产量的高保真多核苷酸。

概述

本发明的各方面涉及制备和/或组装高保真聚合物的方法、系统和组合物。本发明还提供了进行核酸组装反应和组装核酸的设备和方法。本发明的一个目的是提供合成定制多核苷酸的可行、经济的方法。本发明的另一个目的是提供生产合成的多核苷酸的方法，该方法的错误率低于通过本领域已知方法制备的合成的多核苷酸。

根据一些实施方式，本发明提供了一种用于生产具有预定序列的目标核酸的方法。在一些实施方式中，该方法包括提供多个寡核苷酸的步骤，其中各寡核苷酸包含(i)与目标核酸的序列的不同部分相同的内部序列，(ii)内部序列5’端之侧的5’侧接序列和内部序列3’端之侧的3’侧接序列，各侧接序列包含引物对的引物识别位点和限制性酶识别位点。在一些实施方式中，该方法还包括使用引物对扩增至少一组寡核苷酸，从而生成多个经扩增的寡核苷酸。随后可使多个经扩增的寡核苷酸在单个池中接触限制性酶和连接酶，其中限制性酶能够识别限制性酶识别位点，从而生成目标核酸。

在一些实施方式中，该方法包括对组装的目标核酸进行测序确认。在一些实施方式中，经扩增的双链寡核苷酸可包含一个序列错误或错配。在一些实施方式中，该方法包括对多个经扩增的寡核苷酸进行错误去除。在一些实施方式中，可使多个经扩增的寡核苷酸接触错配结合剂。所述错配结合剂可选择性地结合包含错配的双链寡核苷酸，导致结合和剪切作用。在一些实施方式中，可使多个经扩增的寡核苷酸接触错配识别剂，例如化学品，如赖氨酸、哌啶等。