[发明专利]用于核酸组装和高通量测序的方法

权利要求书

1.一种生成有预定序列的目标核酸的方法，所述方法包括：

a)提供第一双链寡核苷酸池，其中双链寡核苷酸包含：

(i)与第一目标核酸序列的不同部分相同的内部序列；其中所述内部序列包含与所述第一双链寡核苷酸池中的另一双链寡核苷酸的重叠的区域；以及

(ii)5’侧接序列和3’侧接序列，所述侧接序列各自包含共有引物识别位点和IIS型限制性酶识别位点，所述IIS型限制性酶识别位点被定位，使得IIS型限制性酶消化并去除所述侧接序列并暴露所述内部序列；以及

b)在适于促进限制性酶同时消化和连接的条件下，使所述第一双链寡核苷酸池接触连接酶和能识别所述IIS型限制性酶识别位点的IIS型限制性酶，从而生成第一目标核酸；

其中所述第一目标核酸包含：

(i)与最终目标核酸的一部分相同的内部序列；

(ii)5’侧接序列和3’侧接序列，所述侧接序列各自包含限制性酶识别位点。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一目标核酸是双链分子的两条链。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一目标核酸不包含步骤b)中所述IIS型限制性酶的底物。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述第一双链寡核苷酸池中的所述双链寡核苷酸是通过扩增多个单链寡核苷酸产生，单链寡核苷酸各自对应所述第一双链寡核苷酸池中的双链寡核苷酸的其中一条链，其中通过所述单链寡核苷酸的共有引物识别位点进行扩增。

5.如权利要求4所述的方法，所述方法还包括对经扩增的寡核苷酸进行错配结合或错误去除。

6.如权利要求5所述的方法，其中使所述经扩增的寡核苷酸接触错配结合剂，任选的，所述错配结合剂是MutS。

7.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括在步骤b)后，扩增所述第一目标核酸。

8.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括确认所述第一目标核酸的序列准确性和分离所述第一目标核酸。

9.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：

c)提供包含所述第一目标核酸和第二目标核酸的混合物，其中所述第二目标核酸包含：

(i)内部序列，所述内部序列与所述第一目标核酸的内部序列不同且与所述最终目标核酸序列的一部分相同；

(ii)5’侧接序列和3’侧接序列，所述侧接序列各自包含限制性酶识别位点；以及

d)使所述混合物接触连接酶和能识别所述限制性酶识别位点的限制性酶，从而生成所述最终目标核酸，所述最终目标核酸包含所述第一目标核酸的内部序列和所述第二目标核酸的内部序列。

10.如权利要求9所述的方法，所述第一目标核酸和所述第二目标核酸在适于促进同时消化和连接的条件下进行步骤d)。

11.如权利要求9所述的方法，其中所述最终目标核酸不包含步骤d)中所述限制性酶的底物。

12.如权利要求9所述的方法，所述方法还包括在步骤d)前，扩增所述第一目标核酸和所述第二目标核酸。