[发明专利]一种重组枯草芽孢杆菌及制备的转氨酶和应用

说明书

本发明涉及药物合成及酶工程技术领域，尤其是一种重组枯草芽孢杆菌及制备的转氨酶和应用，其中，将如SEQ ID NO：1所示的生物酶基因连接到pHT43质粒的BamHI和ZraI位点，然后转化到Bacillus subtilisATCC6633中进行表达，即得重组枯草芽孢杆菌。采用该重组枯草芽孢杆菌制得的转氨酶用于合成西他列汀，由化合物II作为起始原料，在缓冲液、助溶剂、辅酶PLP、氨基供体的存在下，经转氨酶催化转化为西他列汀，其反应路线为，

技术领域

本发明涉及药物合成及酶工程技术领域，具体领域为一种重组枯草芽孢杆菌及制备的转氨酶。

背景技术

西他列汀(Sitagliptin)的化学名为(3R)-3-氨基-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并 [4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮(结构式如下所示)。

磷酸西他列汀(sitagliptin phosphate)是一种新型抗II型糖尿病药物，服用方式为口服，毎次一片，一次约100mg剂量，在2006年10月由默沙东公司成功研制并开发，经美国 FDA批准上市，是史上第一个用于治疗II型糖尿病的二肽基肽酶IV(DPP-4)抑制剂类药物。

西他列汀的化学制备法与生物制备法均有报道，其中以ATA177转氨酶用于制备西他列汀最为广泛，国内外多所企业、高校对ATA117转氨酶的优化进行了研究。如CN103608355A中，默沙东公司通过树脂固载ATA117，对转氨酶ATA117多次套用，降低了其生产成本。CN109777813A中，浙江工业大学通过将转氨酶-PLP共固定化，进行西塔列汀的制备，该方法稳定性好，固载酶使用寿命长，有机溶剂耐受性好，可多次重复利用。

目前，关于转氨酶的报道主要在酶活的提高、酶固定化等方面，对于酶催化造成的高COD废水降解的研究鲜有报道。

而且，西他列汀的酶催化为最后一步反应，通过大肠杆菌制备的酶催化剂有细菌内毒素残留，因此需要一种新的高效表达载体以及绿色无污染的表达细胞进行转氨酶的制备。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组枯草芽孢杆菌及制备的转氨酶和应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种重组枯草芽孢杆菌的制备方法：将如SEQ ID NO：1所示的生物酶基因连接到pHT43质粒的BamHI和ZraI位点，然后转化到Bacillus subtilisATCC6633中进行表达，即得重组枯草芽孢杆菌。

采用上述制备方法获得的重组枯草芽孢杆菌。

采用上述重组枯草芽孢杆菌制得的转氨酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述转氨酶的制备方法为：将本发明的重组枯草芽孢杆菌，接种至LB液体培养基中，接种量为培养基体积的1～5％，37℃的条件下，220rpm摇床中过夜培养后，作为种子液；将新鲜的种子液接入TB培养基中发酵培养，37℃的条件下，220rpm摇床中培养至OD₆₀₀在0.6～0.8时向培养基中加入IPTG，IPTG的浓度为0.5mM，再于18℃诱导22h；发酵液诱导结束后，于4℃，12000rpm离心5min，分别收集菌体与上清液；将上清液加入饱和硫酸铵进行沉淀，4℃，12000rpm离心5min收集沉淀并冻干，获得转氨酶粗酶。

本发明所述的转氨酶在合成西他列汀中的应用，其具体合成方法为：

由化合物II作为起始原料，在缓冲液、助溶剂、辅酶PLP(磷酸吡哆醛)、氨基供体的存在下，经转氨酶催化转化为化合物I，即西他列汀，其反应路线为，

所述助溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸丁酯、DMSO中的任意一种，优选为DMSO；