[发明专利]番茄花叶病毒的RT-RAA-LFS快速可视化检测引物、探针和试剂盒及应用

说明书

本发明公开了番茄花叶病毒的RT‑RAA‑LFS快速可视化检测引物、探针和试剂盒及应用，特点是包括根据番茄花叶病毒的运动蛋白和外壳蛋白区段设计特异性引物及荧光探针，引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，其试剂盒包括反应体系如下：29.4μL A缓冲液，2.1μL 10μM的上游引物，3μL10μM的下游引物，0.6μL10μM的探针，1μL RNA植物汁液粗提液模板，11.4μL ddH₂O，2.5μL B缓冲液，总体积为50μL，优点是灵敏度高、特异性强以及检测快速准确。

技术领域

本发明涉及一种番茄花叶病毒的检测，尤其是涉及一种番茄花叶病毒的RT-RAA-LFS快速可视化检测引物、探针和试剂盒及应用。

背景技术

番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）是Virgaviridae科Tobamovirus属的正链RNA病毒。由于该病毒核酸序列与烟草花叶病毒（TMV）高度同源，因此很长一段时间以来，研究人员都将ToMV作为TMV的一个分支来报道。直到1971年，ToMV才与TMV区别开来，并被分离为独立的病毒种类。ToMV可以感染茄科、十字花科、禾本科、藜科和豆科等植物，其中辣椒是ToMV的天然宿主之一。受ToMV侵染辣椒通常会产生局部病变，引起植物的系统性坏死，进而严重影响辣椒的质量和产量。此外近年来，ToMV还引起了木槿、香瓜茄、苣荬菜、大果茄和龙葵引起的病毒病害的报道。

常用的番茄花叶病毒的检测方法主要有生物学检测法，主要通过指示植物作为鉴别寄主进行检测，然而该方法不仅工作量大，需要较大的温室种植寄主植物，且比较费时，有时因气候或栽培等原因，症状反应不十分稳定，个别症状反应难以重复，因此准确率也不高。酶联免疫吸附测定（ELISA）也用于检测ToMV，该方法主要通过研制ToMV的病毒蛋白抗体进行检测。但ELISA方法对实验室设备依赖性较强，灵敏度较低。此外，TMV与ToMV之间具有较高的同源性，研究表明，当样品中两者的浓度大于等于10-25ng/mL时，ELISA分析则会引起交叉反应，无法清楚地区分TMV和ToMV。RT-PCR法作为植物病毒的传统检测方法，在ToMV的检测方面也已有了较为普遍的应用。通过设计ToMV基因序列的特异性引物，建立ToMV的PCR检测技术，其检测灵敏度高，但缺点是依赖PCR法的检测依然离不开实验室的变温仪器，且扩增产物需要凝胶检测分析结果，从采集病叶至检测完成，整个过程仍需至少1天的时间，不利于实现田间快速检测。也有利用多重免疫捕获RT-PCR法等方法检测ToMV，此方法需要浓缩并预纯化病毒颗粒，然后对捕获的病毒粒子进行RT-PCR检测，无需核酸提取。与ELISA比较，该方法将检测灵敏度提高了4个数量级，但该法同时也具有RT-PCR的缺点。德国Loewe Biochemica公司研制的针对ToMV快速检测的胶体金抗体试剂盒（Tomato MosaicTobamovirus LOEWE^®FAST Kit），通过研制胶体金颗粒结合抗ToMV的抗体复合物，以该复合物直接结合病汁液中游离的ToMV病毒颗粒，从而在检测线上呈现肉眼可见的阳性条带。试剂盒的优点在于：操作简单，无需较强的专业背景，无需依赖实验室设备，检测迅速；缺点在于制备ToMV相应胶体金抗体复合物的试纸条需耗费较高的成本，无法形成规模的田间样品检测，其次该方法的灵敏度也有待验证。此外，还有基于血清学的原理建立的流式细胞仪法，采用检测荧光的方式读取结果。制备ToMV的一抗以及标记FITC的二抗，将一抗通过共价键的形式与乳胶颗粒结合，取植物病叶提取物在低温下与乳胶颗粒温育过夜，PBS洗涤后，与二抗孵育，再次洗涤，用流式细胞仪进行荧光检测。单独的ToMV流式细胞仪检测，其灵敏度达4pg/mL。但该方法缺点是对实验室设备的依赖性较强，需要一定的专业背景，且该检测法的前期准备工作繁重，成本较高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强以及检测快速准确的番茄花叶病毒的RT-RAA-LFS快速可视化检测引物、探针和试剂盒及应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：