[发明专利]一种非病毒载体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种非病毒载体及其制备方法与应用，本发明的非病毒载体包括压缩质粒药物的鱼精蛋白，包覆在压缩了核酸药物的鱼精蛋白表面的阳离子脂质体，以及修饰在阳离子脂质体表面的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑透明质酸(DSPE‑PEG‑HA)聚合物。本发明的非病毒载体依靠被动靶向和主动靶向效应，可以在肿瘤组织高效蓄积，增加肿瘤细胞的摄取并且促进核酸药物进入细胞核，加速后续的转录、翻译过程，为基因编辑质粒的递送提供了一种新的候选体系。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，尤其涉及一种非病毒载体及其制备方法与应用。

背景技术

CRISPR/Cas9作为第三代基因编辑技术，具有强大的基因编辑能力，可在DNA水平实 现基因沉默或修正，一旦编辑成功，作用效果永久，应用其治疗血液性疾病、遗传性视网膜 疾病和肿瘤性疾病的临床试验取得一定进展，在肿瘤靶向基因治疗中具有广阔的应用前景。

CRISPR/Cas9系统共有三种实现形式，如递送同时编码Cas9和sgRNA的质粒、递送Cas9 mRNA和sgRNA或者递送Cas9蛋白和sgRNA复合物，即核糖核蛋白复合体。基因编辑发生在细胞核，递送质粒和核糖核蛋白复合物时，载体的细胞核靶向能力至关重要。

CRISPR/Cas9系统递送方法包括物理方法、病毒载体和非病毒载体。物理方法包括微注 射、电穿孔、核感染和膜变形，主要用于体外或离体细胞和组织的基因编辑，其在体内生物 相容性较差；病毒载体，如：慢病毒、腺病毒、腺病毒等相关病毒等，目前已广泛应用于CRISPR/Cas9系统的体内外给药，但存在致癌性、插入突变、免疫原性等安全问题，且装载能力有限，这些严重影响了病毒载体的临床转化；非病毒载体具有包载能力强、免疫原性低、 易于组装的优点，是较为理想的递送方法。

非病毒载体通过静电相互作用、范德华力、氢键和共价键等装载CRISPR/Cas9系统，主 要为脂质体(lipsome)、聚合物、多肽或蛋白、囊泡、DNA纳米线团、无机纳米粒等。为了 发挥基因编辑作用，非病毒载体需要将CRISPR/Cas9系统高效递送到靶细胞的胞浆，对于 CRISPR/Cas9质粒和核糖核蛋白复合物，将其递送到细胞核更有利于促进质粒表达Cas9蛋 白和sgRNA，提高编辑效率。但是现有的非病毒载体在递送过程中，还存在靶向性和稳定性 不高的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种用于基因编辑的非病毒载体，本发明的非病毒载 体依靠被动靶向和主动靶向效应，可以在肿瘤组织高效蓄积，增加肿瘤细胞的摄取并且促进 核酸药物进入细胞核，加速后续的转录、翻译过程，为基因编辑质粒的递送提供了一种新的 候选体系。

本发明的第一个目的是提供一种非病毒载体，所述的非病毒载体包括压缩质粒药物的鱼 精蛋白，包覆在压缩了核酸药物的鱼精蛋白表面的阳离子脂质体，以及修饰在阳离子脂质体 表面的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-透明质酸(DSPE-PEG-HA)聚合物。

进一步地，所述的阳离子脂质体为DOPE/DOTAP/Chol。

进一步地，所述的质粒药物为基因编辑质粒。

进一步地，所述的基因编辑质粒为pCas9/sgMTH1、pCas9/sgKRAS、pCas9/sgPLK1、pCas9/sgMETTL3中的一种或几种。

本发明的第二个目的是提供所述的非病毒载体的制备方法，包括如下步骤：

S1、采用透明质酸和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇为原料制备二硬脂酰基磷脂酰乙 醇胺-聚乙二醇-透明质酸聚合物；

S2、采用DOTAP、DOPE和胆固醇为原料制备阳离子脂质体；

S3、将鱼精蛋白溶液与质粒药物溶液混合孵育，制备鱼精蛋白/质粒药物复合物；