[发明专利]一种非病毒载体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种非病毒载体，其特征在于，所述的非病毒载体包括压缩质粒药物的鱼精蛋白，包覆在压缩了核酸药物的鱼精蛋白表面的阳离子脂质体，以及修饰在阳离子脂质体表面的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-透明质酸聚合物。

2.根据权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于，所述的阳离子脂质体为DOPE/DOTAP/Chol。

3.根据权利要求1所述的非病毒载体，其特征在于，所述的质粒药物为基因编辑质粒。

4.根据权利要求3所述的非病毒载体，其特征在于，所述的基因编辑质粒为pCas9/sgMTH1、pCas9/sgKRAS、pCas9/sgPLK1、pCas9/sgMETTL3中的一种或几种。

5.一种权利要求1～4任一项所述的非病毒载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、采用透明质酸和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇为原料制备二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-透明质酸聚合物；

S2、采用DOTAP、DOPE和胆固醇为原料制备阳离子脂质体；

S3、将鱼精蛋白溶液与质粒药物溶液混合孵育，制备鱼精蛋白/质粒药物复合物；

S4、将鱼精蛋白/质粒药物复合物与阳离子脂质体混合孵育，得到阳离子脂质体包覆的鱼精蛋白/质粒药物复合物；

S5、将阳离子脂质体包覆的鱼精蛋白/质粒药物复合物与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-透明质酸聚合物的水溶液混合孵育，得到所述的非病毒载体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S3步骤中，孵育是在20～30℃孵育4-6min，鱼精蛋白与质粒药物的质量比为1.8-2.2:1。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S4步骤中，孵育是在20～30℃孵育15-25min，鱼精蛋白/质粒药物复合物与阳离子脂质体的质量比为3:11-11.5。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S5步骤中，孵育是在50-60℃孵育15-25min，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-透明质酸聚合物的水溶液中，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-透明质酸聚合物的浓度为19-21mg·mL^-1。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S1步骤中，透明质酸通过活化剂活化后与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇进行反应，所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺中的一种或几种。

10.权利要求1～4任一项所述的非病毒载体在递送CRISPR/Cas9系统中的应用。