[发明专利]一种新型多样本多片段DNA甲基化检测方法

权利要求书

1.一种非疾病诊断目的的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提取样本基因组DNA或游离DNA，对提取的DNA使用重亚硫酸盐进行处理，然后使用特异性引物对处理好的DNA进行依赖甲基化多重PCR；其中针对不同基因或不同甲基化位点使用不同的特异性PCR引物；

S2、多重PCR产物处理和纯化：对步骤S1获得的多重PCR产物用核酸内切酶或者DNA片段分选磁珠进行处理，然后进行纯化；

S3、对步骤S2获得的纯化产物的甲基化水平进行检测；

步骤S1所述依赖甲基化多重PCR的扩增方法为降落PCR法；

所述依赖甲基化多重PCR的反应酶为Phusion DNA聚合酶；

步骤S2所述DNA片段分选磁珠为XP磁珠；

所述纯化为使用磁珠法进行纯化，其中磁珠为XP磁珠。

2.根据权利要求1所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述样本包括生物组织样品、细胞样品或流体样品。

3.根据权利要求2所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述样本为血液、玻璃体、痰、尿、眼泪、汗液、唾液。

4.根据权利要求1所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，步骤S1所述依赖甲基化多重PCR的反应条件为：98 ℃ 30 s-5 min；10-25个循环。

5.根据权利要求4所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，每个循环为：98 ℃ 15 s，60±10 ℃ 15 s-10 min，68-72 ℃ 15 s-5 min；68-72 ℃ 0-15 min。

6.根据权利要求4所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，步骤S1所述依赖甲基化多重PCR的反应条件为：98 ℃ 30 s；5-10个循环，每个循环为：98 ℃ 15 s，65±3 ℃，且每一个循环后下降0.2-0.8 ℃，15 s，72 ℃ 15 s；10-25个循环，每个循环为：98℃ 15 s，60±10 ℃ 15 s-10 min，68-72 ℃ 15 s-5 min；72 ℃ 0-15 min。

7.根据权利要求1~6任一项所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤S1中同时对不同基因和参考序列进行依赖甲基化多重PCR。

8.根据权利要求7所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述参考序列选自参考序列1~4中的至少一种：

参考序列1：以SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26为特异性PCR引物进行PCR扩增的片段在EPHA3基因中所对应的序列；

参考序列2：以SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28为特异性PCR引物进行PCR扩增的片段在KBTBD4基因中所对应的序列；

参考序列3：以SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30为特异性PCR引物进行PCR扩增的片段在PLEKHF1基因中所对应的序列；

参考序列4：以SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32为特异性PCR引物进行PCR扩增的片段在SYT10基因中所对应的序列。

9.根据权利要求8所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述参考序列选自参考序列1~4中的至少两种。

10.根据权利要求1所述的多样本多片段DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述不同基因的序列选自SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.8所示序列中的至少一种。