[发明专利]一种人乳头瘤病毒分型定量检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种人乳头瘤病毒分型定量检测试剂盒，用于HPV16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV52、HPV 58进行分型和定量分析、以及除以上6种型别以外其他型仅进行定量分析，其特征在于：包括：核酸扩增反应液、HPV-a组反应液、HPV-b组反应液、阳性对照、弱阳性对照、阴性对照；

核酸扩增反应液主要由2×PCR缓冲液、终浓度2～4mM MgCl2、0.05-0.5mM dNTPs(dATP：dTTP：dCTP：dGTP：dUTP＝1:1:1:1:1)、1～2U DNA聚合酶、0.05～0.1U UNG酶及去RNA酶水组成；

HPV-a组反应液和HPV-b组反应液包括了如SEQ ID No.1至SEQ ID No.34的引物探针；

所述阳性对照和弱阳性对照主要组分为不同浓度的人工合成的基因、C33a人宫颈癌细胞系DNA、10mM Tris(PH7.4)、1mM EDTA、5mg/ml海藻糖；

所述阴性对照主要组分为C33a人宫颈癌细胞系DNA、10mM Tris(PH7.4)、1mM EDTA、5mg/ml海藻糖；试剂盒反应体系的灵敏度确定为200copies/mL，其感染单位的绝对偏差不超过±0.5个对数数量级。

2.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒分型定量检测试剂盒，其特征在于：探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团，其中荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、TAMRA、ROX、CY3.5或CY5中的任意一种或几种；淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL和MGB中的任意一种或几种。

3.一种利用权利要求1或2所述的试剂盒检测人类乳头瘤病毒核酸的定量检测方法，其特征在于：采用实时荧光PCR技术和水解探针技术，主要以人乳头瘤病毒基因组L1、E7等区为靶区域，设计监测18个型别的引物和探针，其中包含型别特异性引物探针和通用型引物探针，分别以FAM、VIC/HEX、ROX、CY5等基团标记相应探针，在同一反应体系中可一次性定性检测18种型别人乳头瘤病毒及采集样本的细胞数，样本中宫颈脱落细胞数的获取通过参考基因与待测细胞的线性关系获得。

4.根据权利要求3所述的试剂盒检测人类乳头瘤病毒核酸的定量检测方法，其特征在于：将配制的PCR反应液加好检测模板后放置于荧光定量PCR仪器中进行检测，实验检测程序具体为：UNG酶处理50℃5min；95℃10min预变性；变性、退火、延伸及检测荧光条件为：95℃10s，58℃30～40s，45cycles，58℃时荧光检测，反应体系配置方法为：10～20μL核酸扩增反应液，10～20μL引物探针反应液，5～20μL待测样本核酸。

5.一种对人类乳头瘤病毒定量检测和分型的方法，其特征在于：对重要型具体为HPV16、18、31、33、52、58进行分型和定量分析，除以上6种型别以外其他型仅进行定量分析，而不涉及具体分型，最终通过不同型别致癌性的差异，根据权重来测算HPV感染的综合分值，进行风险分层；型别权重如下：

表格中权重的x为绝对风险值，x前的数值为相对风险值。

6.根据权利要求5所述的对人类乳头瘤病毒定量检测和分型的方法，其特征在于：所述绝对风险值和相对风险值计算方式如下：