[发明专利]一种脑脊液类器官的培养基及其培养方法

权利要求书

1.一种脑脊循环肿瘤细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：

（1）将细胞捕获滤膜置于无水乙醇溶液中进行浸洗，确保所述细胞捕获滤膜完全浸润；

（2）采用1×PBS完全浸润并洗涤所述细胞捕获滤膜，保证残余乙醇彻底去除；

（3）截留细胞富集：将脑脊液加入到PBS中进行稀释，采用步骤（2）洗涤过的所述细胞捕获滤膜对稀释后的所述脑脊液进行过滤，然后采用HBSS缓冲液对所述细胞捕获滤膜进行多次洗涤，至膜上无可见残留物；

（4）无菌镊子夹取步骤（3）的所述细胞捕获滤膜，置于基础培养基中进行培养，形成脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；将所述脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液进行离心，弃上清液，得到重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液，所述基础培养基为：DMEM/F12培养液中添加1% 1×Glutamax，10 mM HEPES缓冲液，100U/ml 青霉素，0.1mg/ml链霉素，1.5% 生长因子B27 supplement，1% 生长因子N2 supplement，50ng/ml生长因子EGF，100 ng/ml生长因子FGF-10， 1μg/ml生长因子IGF1， 0.2%的抗生素primocin，10 uM抑制剂SB431542，1%MEM-NEAA和1ug/ml Heparin50；

（5）将分化培养基重悬备用；将温和细胞解离试剂和含有15 mM HEPES的DMEM/F-12置于冰上备用；冰上解冻Matrigel备用；将低黏附培养皿进行预热；所述分化培养基为：由50%DMEM/F12培养液和50% Neurobasal培养基组成混合培养基，在所述混合培养基中添加0.5%生长因子N2 supplement，1%生长因子B27 supplement，3.5ul/L 2-mercaptoethanol，0.025% insulin，1% 1×Glutamax，0.5% MEM-NEAA和10 µM Y-27632；

（6）先向每个预热后的低黏附培养皿中加入重悬后的所述分化培养基；再将解冻后的Matrigel和步骤（4）得到的所述重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液加入到所述低黏附培养皿中，混合均匀，于培养箱中进行培养。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）中，将细胞捕获滤膜置于1-2mL 75%的乙醇溶液中进行浸洗，重复3次以上，确保所述细胞捕获滤膜完全浸润。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述细胞捕获滤膜的孔径为8μm。

4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（2）中，采用1×PBS完全浸润并洗涤所述细胞捕获滤膜5次以上，保证残余乙醇彻底去除。

5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（3）中，将脑脊液沿模具内壁缓慢加入到PBS中以质量比为1：1的比例进行稀释，采用洗涤过的所述细胞捕获滤膜对稀释后的所述脑脊液进行捕获。

6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（4）中，所述细胞捕获滤膜置于所述的基础培养基中进行培养时，每3-5天换一次培养基，培养时间为11-15天。

7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（5）中，所述预热具体为：将所述低黏附培养皿置于37℃孵箱预热30分钟。