[发明专利]一种用于制备产前胎儿21-三体综合征检测的PCR反应体系的特异性引物

说明书

本发明涉及一种用于产前胎儿21‑三体综合征的检测方法，包括待测样本采集、甲基化DNA免疫共沉淀、酶切、配制PCR反应体系、PCR反应和分析等步骤，本发明提供了一组胎儿特异性甲基化位点及其对应引物序列，该位点分别位于21及3号染色体上，这些位点上母体则相应的无甲基化，因此可在特异性富集后，通过对比21号染色体及3号染色体上的基因相对丰度，确定胎儿21‑三体风险。本发明涉及8个位点的检测，其结果可相互验证，从而提高诊断准确性。本发明可以快速进行产前胎儿三体检测，检测时间短、成本低、有望替代无创DNA检测中的二代测序环节，减少产妇家庭的检测费支出，减轻年轻家庭的经济压力，带来良好的经济效益和社会效益。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种21-三体综合征的检测方法，特别涉及一种用于产前胎儿21-三体综合征的检测方法，

背景技术

21-三体综合症即唐氏综合症(DS，Down's syndrome)是当前最常见的遗传疾病。在新生儿中，21-三体综合症的发病率高达1/700，并且发病率会随着产妇年龄的增加而上升。由于该疾病无法治疗，因此预防手段主要是通过产前筛查来进行，但传统的侵入性技术，包括妊娠早期绒毛活检、妊娠中期羊膜腔穿刺、妊娠中晚期脐血穿刺等技术，存在较高的孕妇宫内感染、早产及流产风险。此外，细胞遗传学诊断需大约4周时间，存在费时、易培养失败以及不能检测较小的染色体结构畸变等缺点。唐氏筛查技术基于血清学检测进行，但其准确度相对较低，因此只能作为预筛选手段。

随着孕妇外周血中胎儿游离DNA的发现，研究者发现其可用于指示胎儿遗传病的风险，即胎儿游离DNA中包含了胎儿的所有遗传信息。香港中文大学卢煜明教授与霍普金斯大学团队合作，以二代测序为基础，开发出基于孕妇外周血中游离胎儿DNA(cfDNA)的产前检测方法，该方法主要基于二代测序技术进行，对比不同染色体上的基因丰度差异或突变情况，确定三体及遗传病风险。该技术检测灵敏度高且数据分析结果较为准确，因而目前已在国内外临床上广泛推广应用。但二代测序操作程序繁杂，单次运行成本偏高，此外，cfDNA片段化严重，提取得率低等问题，加大了DNA文库的制备难度。

发明内容

进一步的研究结果表明，孕妇和胎儿在部分位点甲基化水平上存在差异，从而提示我们可利用特异性核酸内切酶或甲基化免疫沉淀的方法来富集孕妇外周血中的胎儿游离DNA，从而在去除母体DNA的情况下，检测胎儿三体风险。但考虑到荧光定量PCR等分子检测技术本身的误差，以及胎儿/母体DNA含量的个体差异性等因素，有必要通过多组位点的组合检测，提高诊断准确率。

本发明提供一种用于产前胎儿21-三体综合征的检测方法，包括以下步骤：

(1)待测样本采集：

采集待测母体外周血500μL-1mL，采用通用核酸柱式抽提试剂盒进行血液游离DNA提取，所获得DNA样品经微量紫外分光光度计检测获得浓度及纯度，DNA样品纯度为1.8～2.0，将DNA样品稀释得到待测DNA样本；

(2)甲基化DNA免疫共沉淀：

按照甲基化DNA免疫共沉淀试剂盒使用说明书要求，对待测DNA样本(Sample)、阳性对照(Positive control)、阴性对照(Negative control)进行甲基化DNA分离，在最终洗脱甲基化DNA环节加入ddH₂O溶解洗脱甲基化DNA；

(3)酶切：

按照HpaII酶切反应体系处理，将待测DNA样本、阳性对照、阴性对照的甲基化DNA配制酶切反应体系，配制好的酶切反应体系在37℃水浴2h进行酶切反应，反应后在80-90℃水浴20-30min灭活HpaII酶，得到cut待测DNA样本、cut阳性对照、cut阴性对照；

(4)配制PCR反应体系：