[发明专利]一种用于制备产前胎儿21-三体综合征检测的PCR反应体系的特异性引物

权利要求书

1.一种用于产前胎儿21-三体综合征的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)待测样本采集：

采集待测母体外周血500μL-1mL，采用通用核酸柱式抽提试剂盒进行血液游离DNA提取，所获得DNA样品经微量紫外分光光度计检测获得浓度及纯度，DNA样品纯度为1.8～2.0，将DNA样品稀释得到待测DNA样本；

(2)甲基化DNA免疫共沉淀：

按照甲基化DNA免疫共沉淀试剂盒使用说明书要求，对待测DNA样本、阳性对照、阴性对照进行甲基化DNA分离，在最终洗脱甲基化DNA环节加入ddH₂O溶解洗脱甲基化DNA；

(3)酶切：

按照HpaII酶切反应体系处理，将待测DNA样本、阳性对照、阴性对照的甲基化DNA配制酶切反应体系，配制好的酶切反应体系在37℃水浴2h进行酶切反应，反应后在80-90℃水浴20-30min灭活HpaII酶，得到cut待测DNA样本、cut阳性对照、cut阴性对照：

(4)配制PCR反应体系：

将获得的cut待测DNA样本、cut阳性对照、cut阴性对照分别使用9组引物配制PCR反应体系，每个样品每组引物配置3-6个体系重复，9组特异性引物中包括1组常规染色体位点检测引物和8组21号染色体位点检测引物；

(5)PCR反应：

使用实时荧光定量PCR仪进行PCR反应和荧光测定，PCR过程如下：

第一阶段、预变性：PCR反应体系在95℃下反应5min；

第二阶段、循环反应：PCR反应体系在95℃下反应10sec后在60℃下反应30sec；

第三阶段、获得溶解曲线：PCR反应体系在95℃下反应15sec后，在60℃下反应30sec；再升温至95℃反应15sec，得到溶解曲线；

(6)分析：

使用实时荧光定量PCR仪自带的分析软件分析实验结果，将获得的Cq值进行分析，Cq值包括待测DNA样本Cq值：Cq_样本，阳性对照Cq值：Cq_阳性对照，阴性对照Cq值：Cq_阴性对照；各自将21号染色体上8个位点的Cq值与常规染色体的Cq值相比，获得比值R；若4个以上位点R_阳性对照≈R_样本＞R_阴性对照，则说明胎儿21三体概率极高，建议进行羊水穿刺做核型分析确认；若1-4个位点R_阳性对照≈R_样本＞R_阴性对照，则建议复查；若所有位点R_阳性对照＞R_样本≈R_阴性对照，则说明胎儿21三体概率极低，可放心生育。

2.根据权利要求1所述的一种用于产前胎儿21-三体综合征的检测方法，其特征在于：(1)待测样本采集步骤中，用去离子水将待测样本DNA样品浓度稀释为50ng/μl。

3.根据权利要求1所述的一种用于产前胎儿21-三体综合征的检测方法，其特征在于：(2)甲基化DNA免疫共沉淀集步骤中，所述的阳性对照为21三体综合征胎儿羊水穿刺细胞中提取的DNA与健康成年人体的外周血中获得的血细胞DNA按1:20比例混合获得的标准品，浓度为50ng/μl；所述的阴性对照为健康女性成年人体的外周血中获得的血细胞DNA，浓度为50ng/μl；甲基化DNA分离过程中每组的DNA含量不少于0.8μg。

4.根据权利要求1所述的一种用于产前胎儿21-三体综合征的检测方法，其特征在于：(3)酶切集步骤中，酶切反应体系中，DNA样本、HpaII酶、10xBuffer、ddH₂O的体积比为40:1:5:4，每个样本配制的酶切反应体系体积为50μl；酶切反应体系中DNA样本浓度为50ng/μl；HpaII酶的浓度为5U/μl。

5.根据权利要求1所述的一种用于产前胎儿21-三体综合征的检测方法，其特征在于：(4)配制PCR反应体系集步骤中，PCR反应体系中，荧光定量PCR2×预混液、上游引物、下游引物、样本/对照、ddH₂O的体积比为25:1:1:1:22；每个样品每组配制的PCR反应体系体积分别为20μl。

6.根据权利要求1所述的一种用于产前胎儿21-三体综合征的检测方法，其特征在于：(4)配制PCR反应体系集步骤中，所述的9组特异性引物如下：

第1组用于3号常规染色体位点的检测：

上游引物Ch3-F：AGCTGGCACCCGCTGG

下游引物Ch3-R：GTGTGGGGTTGCACGCG

第2组用于21号染色体位点1的检测：

上游引物ERG-F：CAGGAGGCTGAGGCAGGG

下游引物ERG-R：GGTACAGGTTGGGAGTTTGGG

第3组用于21号染色体位点2的检测：

上游引物AIRE-F：TAGTAAGGGAGGGCCGAGAA

下游引物AIRE-R：CAGAGCCAGAACGCACAGAG

第4组用于21号染色体位点3的检测：

上游引物SIM-F：ACCGGGCCTTCTGTCTGTC

下游引物SIM-R：TCTGCACGCTTCAATCCTTC

第5组用于21号染色体位点4的检测：

上游引物NIPK4-F：GAGCCAGGTCTGTTCTCCACG

下游引物NIPK4-R：AGCCGATGCCCTTGTTGC

第6组用于21号染色体位点5的检测：

上游引物YBEY-1F：GGTTCGTGCACTCGCTGAG

下游引物YBEY-1R：GCCTTCTCCTTCTGGAACATCT

第7组用于21号染色体位点6的检测：

上游引物JAM2-F：TTTTGGGCCACATCATTCT

下游引物JAM2-R：GCTGGGATTACAGGCGTGAG

第8组用于21号染色体位点7的检测：

上游引物DSCAM-F：CCTAAGACCTTTGCCTAGCTTCT

下游引物DSCAM-R：TCCTTTATGGGATTTCTGTTGTG

第9组用于21号染色体位点8的检测：

上游引物PCNT-F：AGCAGACACGGGCTCGGT

下游引物PCNT-R：CGGTGCTCAGCAACCACC

每组上游引物和下游引物的浓度分别为10μM。