[发明专利]一种检测牛冠状病毒的检测方法

说明书

本发明是基于微滴式数字PCR技术检测牛冠状病毒的检测方法，包括目标片段如SEQ ID NO.1，所特异性引物对和探针。本发明牛冠状病毒微滴式数字PCR检测试剂盒的灵敏度为1copies/μL，并只能特异性检测牛传冠状病毒。使用本发明的试剂盒检测临床采集的牛腹泻样品，结果表明其阳性率高于现有的qPCR，可以实现痕量病毒的检测，且无需标准曲线即可对核酸进行绝对定量。本发明的检测方法可实现对牛冠状病毒的高特异性、高灵敏度、绝对定量检测，具有高通量检测、精确度更高、更数字化、节约时间等优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于微滴式数字PCR技术检测牛冠状病毒的引物和探针及其试剂盒制备方法与应用。

背景技术

牛冠状病毒(Bovine coronavirus，BCoV)属套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒亚科、乙型冠状病毒属B亚群。BCoV是单股、正链RNA病毒，病毒基因组大小为27000-32 000nt，是已知RNA病毒中基因组最大的。BCoV的基因组主要编码5种蛋白，分别是核衣壳蛋白(N)、纤突蛋白(S)、主要嵌膜蛋白(M)、次要嵌膜蛋白(E)和血凝素酯酶(HE)，N基因编码的核衣壳蛋白具有高度的保守性。BCoV主要感染牛，1周龄犊牛最易感，且可造成成年牛持续性的亚临床感染。经呼吸道感染和粪口感染是BCoV常见的传播途径，患病动物可通过呼吸道粘膜分泌物和粪便等将病毒排出体外，因为BCoV对粘土具有良好的吸附性，所以接触被污染的土壤也可能造成动物感染。自1973年被美国学者CA Mebus首次报道后，随着畜牧业的发展，BCoV目前已遍布全世界，我国多地也有牛冠状病毒感染的相关报道。BCoV是引起成年牛冬痢和犊牛腹泻的重要病原之一，患病动物最初发生黄色至含血粘液的腹泻，随后发展为大量水样腹泻，如不能及时补水，则会发生脱水和代谢性酸中毒，并出现精神抑郁、体温过低等全身症状，严重时会导致昏迷甚至是死亡，犊牛感染后常影响其生长发育，且会导致母牛产奶量下降，对养牛业的发展造成了巨大的损失。

现有的实验室BCoV检测技术主要有病毒的分离鉴定、血凝(HA)与血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、RT-PCR检测技术和荧光定量PCR检测技术等。但是这些方法存在着操作复杂、耗时过长、特异性差、灵敏度低等问题，对混合感染和低病毒载量的临床样本无法有效检出。而实时荧光定量PCR进行的绝对定量，需要通过绘制随时间变化的荧光强度曲线才能实现将含量转化为绝对的浓度，而这些浓度受到环境的影响是会产生变化的，精确度得不到保障，因此该绝对定量是不够绝对的。微滴式数字PCR(Droplet DigitalPCR，ddPCR)，作为第三代PCR技术，是基于传统PCR、实时荧光定量PCR基础上发展起来的，ddPCR无需构建标准曲线就可直接进行绝对定量检测，它既能对荧光定量PCR起到辅助作用，又能代替荧光定量PCR，实现更灵敏、更准确的绝对定量。ddPCR克服了传统PCR和荧光定量PCR系统难以精确测定基因拷贝数、无法对痕量突变定性和定量检测、精确度低、高成本、通量有限、流程复杂等缺点，具有高通量检测、精确度更高、更数字化、节约时间等优点。

发明内容

本发明的目的是建立一种牛腹泻冠状病毒微滴式数字PCR检测技术，该技术针对BCoV建立一种快速、灵敏度高、特异性好、高通量的检测方法，为有效防控BCoV提供一种新的手段。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：一、一种用于检测牛冠状病毒的特异性片段，如SEQ ID NO.1所示，属于牛冠状病毒N基因部分片段。

二、用于扩增上述的特异性片段的引物组和探针，所述引物组的上游引物为5’-GATCTACTTCACGCGCATCC-3’，如SEQ ID NO.2所示，

下游引物为5’-GTGGCTTAGTGGCATCCTTG-3’，如SEQ ID NO.3所示；

所述探针为5’-FAM-TGGCTCTACTGCGCGATCCTGCA-BHQ1-3’，如SEQ ID NO.4所示，其中，5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有淬灭基团BHQ1。