[发明专利]恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用

权利要求书

1.非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提供一种核酸的步骤，该核酸3’至5’方向依次由M1c、F1c、M、R1、M2c区组成，其中M区包括M1和M2区，该核酸5’端的M2c区和3'端的M1c区分别与M2区和M1区互补；所述核酸5’端的M2c区和3’端的M1c区与同一链上的M区的退火能形成闭合环结构；

2）使第一寡核苷酸I与步骤1）提供的所述核酸的F1c区退火，然后以所述第一寡核苷酸I的F1区作为合成起点，进行合成步骤；其中所述第一寡核苷酸I包括M1区与Fl区，其中F1区与F1c区互补；

3）步骤1）提供的所述核酸的3’端的M1c区与M1区退火，以该核酸为模板合成其自身的互补链，将合成完后的核酸序列称为核酸A；

4）使第二寡核苷酸II与步骤3）提供的所述核酸A的R1c区退火，然后以所述第二寡核苷酸II的R1区作为合成起点，进行合成步骤；其中所述第二寡核苷酸II包括R1区和M2c区，其中R1区与R1c区互补；

5）步骤3）提供的所述核酸A的3’端的M区与临近的Mc区退火，以核酸A为模板合成其自身的互补链。

2.根据权利要求1所述的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于：所述获得的核酸链能够自主配对无限延伸，该核酸链上3’端的M1c区会与该链上的互补区段M1区配对作为合成起点以自身为模板使所述核酸链不断延伸。

3.根据权利要求1所述的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于：所述合成核酸的方法中通过引入加速F2/R2引物对和/或LF/LR引物对的方法使得核酸扩增加速进行；其中F2/R2是位于原始核酸互补链的F1区及R1区的5’侧的区段，LF/LR是位于F1区到M1c区及M2区到R1的中间区段。

4.根据权利要求1所述的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于：步骤1）中所述的一种核酸的合成方法，包括以下步骤：

1-a）退火步骤，使第一寡核苷酸I与模板的F1c区退火，其中所述模板3’至5’方向依次由F1c区、M区和R1区组成，其中M区包括M1和M2区，所述第一寡核苷酸I包括M1区与Fl区，所述M1区与F1区的5’侧相连，其中，

F1区：具有与F1c区互补的核苷酸序列的区，

M1区：与M区中M1相同的核苷酸序列的区；

1-b）以所述第一寡核苷酸I的F1区作为合成起点，合成第一核酸；所述第一核酸具有与所述模板互补的核苷酸序列，所述第一核酸的5’末端具有可与同一条链上的M1c区退火的M1区，并且通过所述M1c区与M1区的退火可形成茎环；

1-c）在恒温条件下，使第二寡核苷酸II与所述第一核酸的R1c区退火，其中所述第二寡核苷酸II包括R1区和M2c区，并且M2c区与R1区的5’侧相连；其中，

R1区：具有与R1c区互补的核苷酸序列的区，

M2c区：与M区中的M2区互补的核苷酸序列的区；

1-d）以所述第二寡核苷酸II的R1区作为合成的起点，合成第二核酸，得到目标核酸片段。

5.根据权利要求4所述的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于：步骤1-a）所述模板为RNA，步骤1-b）中的第一核酸通过具有反转录酶活性的酶来合成。

6.根据权利要求4或5所述的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于：所述F1区、M区和R1区的核酸片段均为20bp。