[发明专利]柑桔黄龙病菌分子荧光RAA检测引物探针组、试剂盒及方法

说明书

本发明提供了一种柑桔黄龙病菌分子荧光RAA检测引物探针组、试剂盒及方法。本发明提供的检测试剂盒包括一条正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，一条反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，一条特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，可用于快速高效完成柑桔黄龙病菌检测，检测灵敏度可达到10copies/μL，特异性非常好，与柑桔黄龙病菌以外的菌株均无交叉反应，操作更简便快速，无需电泳检测，避免核酸扩增产物开盖污染的风险，适宜于柑桔黄龙病菌的快速检测。

本发明要求以申请日为2020年06月18日，申请号为2020105604821，名称为“柑桔黄龙病菌分子荧光RAA检测引物探针组、试剂盒及方法”的发明专利申请为优先权。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌分子荧光RAA 检测引物探针组、试剂盒及方法。

背景技术

柑桔黄龙病是一种由韧皮杆菌引起的植物检疫性病害。主要侵染柑桔属、金柑属和枳属等柑桔类植株。由菌种苗远距离传播，田间主要由柑桔木虱取食传播。典型受害植株叶片斑驳不均匀黄化，枝梢黄化，果实畸形，种子败育，严重时可引起植株死亡。

引起柑桔黄龙病毒的韧皮杆菌根据其核糖体基因序列的差异可以分为3种，即分布于非洲的柑桔黄龙病韧皮杆菌Candidatus Liberibacter africanus，分布于南美洲的柑桔黄龙病美洲韧皮杆菌Candidatus Liberibacter americanus和分布于亚洲及北美洲的柑桔黄龙病亚洲韧皮杆菌Candidatus Liberibacter asiaticus。

柑桔黄龙病的检测方法，自1919年柑桔黄龙病在华南地区被发现以来，有效的诊断技术逐渐成了柑农以及科研工作者高度关注的话题。柑桔黄龙病毒检测技术也经历了漫长的探索过程，到目前为止，该病原的检测方法有很多，主要包括传统检测法、分子生物学检测法等。田间诊断法作为传统的诊断法，曾是检测黄龙病毒的唯一方法，凭借着简单易行、无需任何专业设备等优势在黄龙病毒检测中占有一定的地位，该方法仅需对待检柑橘的叶面及果实特征、传播情况等多方面的情况进行综合考虑，及可以做出诊断结果。但由于黄龙病本身的复杂性等特点，使其容易与其他症状相混淆，误判率高。通常被作为黄龙病的初步诊断技术，不适于黄龙病毒准确诊断。

柑桔黄龙病的分子检测方法目前以荧光PCR法为主，该方法无需开盖，避免了核酸检测过程中的污染风险，而且其检测灵敏度和特异性都要优于其他方法。但该方法需要与专业的实时荧光PCR仪配合使用，使得检测仪器成本很高，而且对实验操作人员有较高的要求。荧光RAA法是一种重组酶介导的核酸链扩增技术，相比荧光PCR技术，荧光RAA 法无需模板的热变性、温度的循环，更适合在有大量样品的非实验室进行检测，更适合现场检测。

急需找到可用于检测柑桔黄龙病的高灵敏度、高特异性、检测速度更快的荧光RAA检测方法，使柑桔黄龙病能够实现更便捷、更精准的现场检测。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种针对柑桔黄龙病菌进行高灵敏度和高特异性的荧光RAA检测的引物探针组、试剂盒及检测方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种柑桔黄龙病菌分子荧光RAA检测引物探针组，所述引物探针组的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中，所述特异性荧光探针的序列中间标记有荧光报告基团、荧光淬灭基团以及四氢呋喃，3’端标记有C3 Spacer。

进一步地，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、 Dabcy1或Tamra中的一种。