[发明专利]一组条码接头以及中通量多重单细胞代表性DNA甲基化建库和测序方法

说明书

本发明提供了一组含样品条码的粘性接头，用于特异标记不同样品；每个接头由短寡核苷酸和长寡核苷酸形成，不同接头设置独特的条码序列；该接头直接连接限制性酶切的基因组DNA片段末端，用于标记多个单细胞或群体细胞或纯化的DNA样品并可进行其扩增。本发明还提供了同时检测多个样品CpG甲基化的方法，简称M‑scRRBS，及其替代性方法M‑scRRAS，采用上述接头特异标记多个样品，包括每个样品的所有DNA片段，再把多个样品合并，实现多样品的单管反应，进行后续的转化、测序文库构建和测序、各样品读数分流解码及下游分析。本发明的建库技术与scWGBS和scRRBS方法相比，具有高效率、低成本、操作稳定方便等优势。

技术领域

本发明涉及DNA测序技术领域，尤其涉及一组条码接头以及中通量多重单细胞代表性DNA甲基化建库和测序方法。

背景技术

甲基化和DNA甲基化研究及其意义：甲基化研究是疾病研究的热点，与基因表达、表型性状息息相关。生物体的DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶 (DNA methyltransferase，DMT)的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程。 DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N-6位、鸟嘌呤的N-7位、胞嘧啶的C-5位等。但在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5'-CpG-3'的C上生成5-甲基胞嘧啶 (5mC)。在哺乳动物中CpG以两种形式存在：①CpG二核苷酸分散于DNA序列中；②CpG二核苷酸呈现高度聚集状态，形成CpG岛(CpG island)。在哺乳动物正常基因组序列中，70％～90％分散的CpG被甲基化修饰，而CpG岛则往往处于非甲基化状态(除有些特殊区域和基因外)，且CpG岛常位于转录调控区附近，与56％的人类基因组编码基因相关，因此对基因转录区CpG岛甲基化状态的研究十分重要。

人类基因组序列草图分析结果表明，人类基因组CpG岛约为28890个，大部分染色体每1Mb就有5-15个CpG岛，平均值为每Mb含10.5个CpG岛。DNA 甲基化与人类发育、分化、衰老和疾病的关系密切，特别是CpG岛甲基化所致抑癌基因转录失活问题，基因组重复序列的低甲基化导致基因组稳定性下降的问题等。DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。

近年来，DNA甲基化特征已成为多种肿瘤诊断和预后的生物标志物。DNA 甲基化的研究为揭示癌症的发生、发展机制，癌症组织的细胞异质性，癌症的早期发现和预后效果评估以及进行癌症的研究治疗提供了可能。除此之外，研究DNA序列中CpG岛的甲基化情况对于从表观水平阐述人类多种疾病的发生发展机理、筛查诊断和治疗靶标都有重要意义。

DNA甲基化测序的经典方法：传统的DNA甲基化研究方法主要有三类： (1)重亚硫酸氢盐特异转化(conversion)非甲基化的胞嘧啶(C)和测序(Bisulfite Sequencing,BS)；(2)甲基化或非甲基化C或CpGDNA的特异性结合，例如：甲基化DNA免疫沉淀(MethylatedDNA Immunoprecipitation,MeDIP)或甲基化结合蛋白(MeCP2)的特异结合富集；(3)甲基化DNA对甲基化敏感限制性核酸内切酶的阻断(Resistance toMethylation-sensitiveRestriction Endonuclease, MRE)。然而，无论是BS、MeDIP，还是MRE，都需要大量的DNA样品才能保证产出可信的读数。而BS方法能精准定量且分辨率可达到给出单个碱基的分辨率，是DNA甲基化分析的金标准。哺乳动物群体细胞基因组CpG和CpG岛甲基化检测以全基因组重亚硫酸氢盐测序(WGBS)和简化代表性重亚硫酸氢盐测序(RRBS)等方法应用最广。