[发明专利]一组条码接头以及中通量多重单细胞代表性DNA甲基化建库和测序方法

权利要求书

1.一组条码接头用于甲基化高通量测序文库构建，其特征在于，包括末端粘性序列、样品条码序列和PCR扩增引物相关序列以及引物，所述条码接头旨在捕获和直接连接并利于多样品高通量转化和扩增含粘性末端的基因组DNA片段，而不形成接头二聚体，用于代表性CpG甲基化测序文库构建。

2.根据权利要求1所述的一组条码接头，其特征在于，所述接头在条码序列和PCR引物之间插入为扩增后切除引物预设的IIs类型的限制性内切酶和预设接头粘性末端相关序列，且所述限制性内切酶酶切后形成3’端突出的1个碱基，而且所述限制性内切酶能够加热灭活。

3.根据权利要求2所述的一组条码接头，其特征在于，所述引物切除所采用IIs类的限制性内切酶序列为5'GTATCCNNNNNT3'，限制性内切酶酶切后形成3’端突出的1个碱基为T，优选地，所述IIs类的限制性内切酶为BciVI。

4.根据权利要求1所述的一组条码接头，其特征在于，所述多个序列不同的条码接头均由短寡核苷酸和长寡核苷酸，对短寡核苷酸的Tm值的基本要求是10℃＜Tm＜60℃，优先地14℃＜Tm＜56℃形成，短寡核苷酸和长寡核苷酸经变性后退火形成长短DNA双链接头，所述双链接头与长寡核苷酸的3'端相对应的末端为粘性，该末端与M-scRRBS程序富集CG片段的限制性内切酶酶切的DNA片段末端直接互补。

5.根据权利要求1或2任一所述的一组条码接头，其特征在于，所述长寡核苷酸从5'端到3'端依次含有部分PCR扩增引物序列、切除引物所需限制性内切酶识别序列和预设接头粘性末端相关序列、及样品条码序列。

6.根据权利要求1或2任一所述的一组条码接头，其特征在于，所述短寡核苷酸从5'端到3'端依次含有末端粘性序列和所述条码序列的互补序列。

7.根据权利要求1-4任一所述的一组条码接头，其特征在于，在M-scRRBS程序中富集CG片段的限制性内切酶为MspI酶的情况下，短寡核苷酸的末端粘性突出序列为5'CG，该CG碱基不与长ologo的3'末端互补而形成粘性末端。

8.根据权利要求1所述的一组条码接头，其特征在于，所述短寡核苷酸的3'端经具有阻止连接或聚合酶延伸功能的基团修饰，包括但不限于3'ddC(3'双脱氧胞苷)、3'InverteddT(3'反向dT)、3'C3 spacer(3'C3间臂)、3'Amino(3'氨基)或3'phosphorylation(3'磷酸化)，优选为3'ddC，或优选3'Amino。

9.根据权利要求1-8任一所述的一组条码接头，其特征在于，所述短寡核苷酸和长寡核苷酸的每个位置的碱基为A、T、C和G中任意一种，3种2种碱基中任意一种，或特定碱基；其中，所述长寡核苷酸中的胞嘧啶选用甲基化胞嘧啶(5mC)。

10.根据权利要求1-9任一所述的一组条码接头，其特征在于，所述条码序列的碱基个数为2-10个，优选为6个。

11.根据权利要求1-10任一所述的一组条码接头，其特征在于，所述多个不同的条码接头的条码序列不同，而一组多个序列不同的条码接头的PCR扩增引物序列相同。

12.根据权利要求1-11任一所述的一组条码接头和引物，任意2个核苷酸位置之间具有稳定核苷酸而免于被核酸酶降解的修饰，优选地，其接头5'和/或3'末端及近末端第1-5核苷酸之间予以修饰，更优选地，近末端第1-3核苷酸之间予以修饰，优先地，所述修饰为phosphorothioate(硫代磷酸酯)修饰。

13.根据权利要求1所述的一组条码接头，其特征在于，所述样品可为单细胞、群体细胞或提取纯化的DNA。