[发明专利]双基因缺陷型工程菌及其在提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的应用

说明书

本发明公开了一种双基因缺陷型工程菌，所述双基因缺陷型工程菌含有BsGlmS基因和GAN1基因，并通过敲除宿主菌的endA1基因和nagK1基因获得。本发明还公开了该菌株的制备方法及其应用。本发明通过敲除了核酸内切酶基因endA1和N‑乙酰氨基葡萄糖激酶基因nagK1提高含N‑乙酰氨基葡萄糖合成途径的工程菌的乙酰氨基葡萄糖产量。利用本发明获得的产乙酰氨基葡萄糖工程菌进行发酵，可显著提高其产量，具有产业化应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及双基因缺陷型工程菌及其在提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的应用。

背景技术

N-乙酰葡萄糖胺存在于所有生物体中，在人体中是透明质酸、硫酸软骨素及硫酸角质素等葡糖胺多糖的二糖单元前体。N-乙酰葡萄糖胺特异性地作用于关节软骨，对于维持软骨的健康和正常的关节功能具有重要作用；N-乙酰葡萄糖胺可以增加皮肤中透明质酸的含量；此外N-乙酰葡萄糖胺还是合成乙酰神经氨酸的前体物质。目前N-乙酰葡萄糖胺主要通过水解几丁质合成，化学法水解环境污染严重，水解几丁质的酶合成量低，不利于工业化生产。微生物发酵因其发酵周期短、产量高引起了越来越多的关注。

目前，已经实现了基于质粒表达系统的微生物工程菌用于N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产。质粒DNA的稳定性直接影响代谢途径蛋白质的表达水平。N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸是N-乙酰氨基葡萄糖的前体物质。在微生物细胞内存在将N-乙酰氨基葡萄糖磷酸后反向转化为其前体物质N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸的关键酶N-乙酰氨基葡萄糖激酶。现有技术主要还是基于质粒表达系统的工程菌，普遍存在产物产量不稳定的情况，且产物中容易残留较多的氨基葡萄糖致使终产物N-乙酰氨基葡萄糖的转化率降低，同时给N-乙酰氨基葡萄糖的分离纯化带来难度。

发明内容

发明目的：为解决现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一种核酸内切酶基因endA1和N-乙酰氨基葡萄糖激酶基因nagK1双缺陷型大肠杆菌工程菌。本发明通过敲除宿主细胞内核酸内切酶基因endA1和N-乙酰氨基葡萄糖激酶基因nagK1，一方面提高质粒DNA的稳定性，一方面阻断N-乙酰氨基葡萄的逆转化从而促使催化反应尽可能的朝合成N-乙酰氨基葡萄的方向进行，从而实现N-乙酰氨基葡萄糖产量的提高。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述双基因缺陷型大肠杆菌工程菌的构建方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了该双基因缺陷型大肠杆菌工程菌在生产N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种双基因缺陷型工程菌，所述双基因缺陷型工程菌含有BsGlmS基因和GAN1基因，并通过敲除宿主菌的endAl基因和nagK1基因获得。

本发明的由多基因构成的N-乙酰氨基葡萄糖合成途径中的多个基因包含源自枯草芽孢杆菌的编码氨基葡萄糖合成酶的基因BsGlmS和源自酵母菌的编码氨基葡萄糖转乙酰基酶的基因GAN1。

其中，所述宿主菌大肠杆菌包括但不仅限于Escherichia coli、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、JM109、DH5α、TOP10、HB101、DH10B或其他野生型大肠杆菌。

其中，所述BsGlmS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述编码BsGlmS基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述GAN1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述编码GAN1基因的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明内容还包括所述的双基因缺陷型工程菌的构建方法，包括以下步骤：