[发明专利]双基因缺陷型工程菌及其在提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的应用

权利要求书

1.一种双基因缺陷型工程菌，其特征在于，所述双基因缺陷型工程菌含有BsGlmS基因和GAN1基因，并通过敲除宿主菌的endA1基因和nagK1基因获得，所述宿主菌为大肠杆菌，所述BsGlmS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述编码BsGlmS基因的氨基酸序列如SEQID No.2所示；所述GAN1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述编码GAN1基因的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.权利要求1所述的双基因缺陷型工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）含有BsGlmS基因和GAN1基因的重组表达载体的构建；

2）endA1基因缺失型的MG∆endA1菌株的构建：通过同源重组的方法将大肠杆菌的endA1基因敲除得到MG∆endA1菌株；

3）MG∆endA1∆nagK1菌株的构建：通过同源重组的方法将步骤2）得到的MG∆endA1菌株的nagK1基因敲除得到MG∆endA1∆nagK1菌株；

4）将步骤1）构建得到的表达载体转化到步骤3）得到的MG∆endA1∆nagK1菌株中得到endA1和 nagK1双基因缺陷型工程菌。

3.根据权利要求2所述的双基因缺陷型工程菌的构建方法，其特征在于，步骤1）中所述重组表达载体为pTrc99A系列表达载体、pSTV28系列表达载体、pET21系列表达载体或pBR322系列载体。

4.根据权利要求3所述的双基因缺陷型工程菌的构建方法，其特征在于，步骤2）的具体步骤为：

2.1）以pKD13质粒为模板，将敲除目标基因endA1的引物对进行聚合酶链式反应，扩增得到线性同源重组片段；

2.2）以大肠杆菌为出发菌株，将携带Red重组酶的pKD46质粒转入大肠杆菌中，在含氨卞霉素平板培养基上筛选得到转化子；将转化子接入有Amp抗性的LB培养基，并加入诱导剂，制备MG1655/pKD46感受态；

2.3）将步骤2.1）得到的线性同源重组片段电转化进入MG1655/pKD46感受态细胞，倒置培养，挑选转化子，得到带有卡那霉素抗性基因的标记MG∆endA1菌株。

5.权利要求1所述的双基因缺陷型工程菌在生产N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。

6.一种产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）种子培养：将权利要求1所述的双基因缺陷型工程菌的单菌落菌种接种至种子培养基中培养得到种子液；

2）发酵培养：将种子液接种发酵培养基，不额外添加诱导剂，直接利用宿主菌渗漏表达进行代谢通路的基因表达。

7.根据权利要求6所述的产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，步骤2）中，在发酵过程中通入空气，发酵温度为25-38℃，发酵体系的pH值为6.5-7.5。

8.根据权利要求6所述的产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，步骤2）中所述发酵培养基中的碳源为甘油、葡萄糖和淀粉中的一种或几种；所述发酵培养基中的氮源为酵母粉和蛋白胨。