[发明专利]一种利用磁珠探针快速检测环介导等温扩增核酸产物的方法

说明书

本发明提供了一种利用磁珠探针快速检测环介导等温扩增核酸产物的方法，可用于与核酸鉴定相关的诸多领域，其根据环介导等温扩增产物的单链环状区域设计一段与其互补的磁珠探针，将其与待检核酸混合并进行环介导等温扩增反应，磁珠探针识别并结合扩增产物，磁分离后在紫外灯透射下可直接观察荧光，判断检测样品是否为阳性。本发明大大降低了原有环介导等温扩增最大缺陷即假阳性率高的缺点，同时该方法稳定准确，特异性强，操作简便快捷，整个检测过程不需要昂贵的精密设备，降低成本，具有广阔的市场前景。

技术领域

本发明属于生物技术核酸检测领域，具体涉及一种利用磁珠探针快速检测环介导等温扩增核酸产物的方法。

背景技术

目前病原体DNA、RNA的检测主要依赖于PCR技术和qPCR技术，PCR、qPCR虽然能够快速，敏感的检测核酸，但由于其需要昂贵的设备，大大限制了其使用，尤其是在基层医疗机构。而环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)因为其温度恒定，设备简单，操作便捷近些年来备受人们的关注。LAMP需要4-6个引物，经过30-60min后，可将少量核酸扩增至千百万份。与传统PCR相比，LAMP灵敏度更高，比传统PCR高10到100倍，有时甚至单拷贝核酸也可以通过LAMP扩增。LAMP过程中所需温度条件比较稳定，不需要反复的变温，因此所需时间少。最重要的是LAMP过程中不需要复杂昂贵的仪器设备，符合基层和现场病原检测工作的需要。但是LAMP极易产生假阳性结果，这主要是因为LAMP产物气溶胶极易污染环境以及体系中过多的DNA引物可能会形成引物间的非特异性互补而产生假阳性结果。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用磁珠探针快速检测环介导等温扩增核酸产物的方法，旨在解决现有环介导等温扩增检测特定核酸序列时，假阳性率高，检测结果不准确的问题。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种利用磁珠探针快速检测环介导等温扩增核酸产物的方法，包括如下步骤：

S1、设计待检测样本环介导等温扩增引物和制备与待检测样本特异性结合的磁珠探针；

S2、将所述的环介导等温扩增引物与缓冲液与DNA聚合酶预混，加入待检测样本，加温进行反应后得到环介导等温扩增产物；

S3、将所述的磁珠探针加入到所述的环介导等温扩增产物，孵育；

S4、等温扩增液洗涤磁珠，再加入双链DNA染料，孵育；

S5、观察检测信号，判断所述的待测样本是否为阳性。

作为本发明更优的技术方案，所述磁珠探针为根据环介导等温扩增产物的单链环状结构设计互补的单链探针，将该探针修饰于磁珠表面，用于结合环介导等温扩增产物。LAMP产物中的茎环样结构和多环花椰菜样结构中存在很多单链环状DNA结构，根据该单链环状结构设计与之互补的单链DNA探针，DNA探针与磁珠结合形成磁珠探针，通过荧光判断样品中是否存在目标核酸。

作为本发明更优的技术方案，所述磁珠探针中的磁珠为但不限于具有超顺磁性的磁珠。

作为本发明更优的技术方案，所述的待测样本为来自病原体的基因样本。

作为本发明更优的技术方案，所述的病原体的基因样本为病原体DNA样本或是来自于病原体的RNA逆转录样本。

作为本发明更优的技术方案，步骤S5中的所述的检测信号为紫外灯下得到的荧光信号。

作为本发明更优的技术方案，步骤5还包括设置阴性对照组，所述的阴性对照组为无目标核酸序列的待测样本，有荧光或较强，则结果判断为阳性，没有荧光，则结果判断为阴性。

本发明还提供将所述的利用磁珠探针快速检测环介导等温扩增核酸产物的方法应用于检测目标核酸序列中。