[发明专利]一种检测紫外照射后基因组损伤的方法

说明书

一种检测紫外照射后基因组损伤的方法，由双通道TaqMan荧光探针定量检测微生物基因组损伤，包括以下制备步骤：用相应培养基培养得到所需微生物培养液；定量取得所述微生物培养液经裂解离心获得上清液分别作为对照组和实验组模板进行荧光定量PCR扩增，其中实验组培养液经一定紫外强度下照射；采集所述第一对照组、第二对照组和实验组各子组的荧光信号CT值；进而得到第二对照组各子组的ΔCTCK值的标准偏差s和检测限L、实验组各子组CT差值（ΔCTuv）和第一对照组各子组的CT差值的平均值（ΔCTCK‑）；ΔΔCT=ΔCTuv‑ΔCTCK‑作为实验组损伤判据。所述荧光探针定量检测微生物基因组损伤的方法具有较强的特异性和较高的灵敏度，能够用于快速检测紫外照射后的微生物基因组损伤的鉴定。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，特别涉及一种检测紫外照射后基因组损伤的方法。

背景技术

紫外线（UV）照射能使DNA中相邻嘧啶碱基形成以共价键连接的嘧啶二聚体，主要包括环丁烷嘧啶二聚体（CPD）、嘧啶（6-4）嘧啶酮光产物（(6-4)PP）以及杜瓦价键异构体，影响DNA的双螺旋结构，使其复制和转录功能受阻，最终对环境中的有害生物起到灭活的作用。因此提供一种快速检验紫外照射后生物基因组损伤程度的方法来对环境中生物经紫外照射后DNA损伤程度进行准确和快速的检测具有十分重要的意义。

PCR诊断技术又叫多聚酶链式反应技术，它采用分子技术模拟核酸在体内的复制。荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过CT值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析，在扩增的指数期对起始模板进行定量。

在荧光定量PCR技术中的概念—CT值，C代表Cycle，T代表threshold，CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

在荧光定量PCR实验中，起始模板DNA的量与实验的CT值之间存在一定的对应关系。如果微生物受到紫外辐射，基因组DNA发生损伤，会导致实验起始的DNA模板量发生变化，从而给出不同的CT值。要判断一个样品是否经过了紫外辐射，我们在一个反应体系中用两种不同的荧光探针扩增两种长短不同的DNA片段：一个是短片段（60-300bp），由于短片段的损伤概率较小，因此随着紫外辐射剂量的增加，CT值变化较小，可以作为一个参照组；另一个是长片段（1000-2500bp），由于长片段的损伤概率大，因此随着紫外辐射剂量的增加，可用于PCR反应的模板量减少，CT值变化大。

目前以彗星实验为代表的DNA损伤检测技术，主要用来检测真核细胞的DNA损伤，且操作复杂，检测耗时长。以检测嘧啶二聚体为基础的方法有鉴定损伤位点的酶解法，以及利用识别嘧啶二聚体的特异性抗体所衍生的一系列基于抗体免疫的方法，像ELISA，免疫印迹等，还有基于水解DNA的色谱质谱偶联法。其中，酶解法操作复杂，流程多，需要跑胶结合放射性或者荧光标记。抗体法，整个流程步骤多，时间长，对检测人员技能要求较高。色谱质谱偶联法，样本制备复杂，仪器昂贵。这些方法，无法在短时间完成DNA损伤的快速检测要求，对于实时检测来说，还不够省时和便捷。因此，利用荧光定量PCR技术来快速检测紫外照射后微生物基因组DNA的损伤，缩短检测时间，提高灵敏度，是非常必要且急需的。

发明内容

为解决背景技术中提及的至少一个问题，本发明实施方式的目的在于提供一种检测紫外照射后基因组损伤的方法，我们提出的利用双通道TaqMan探针荧光定量PCR技术检测微生物基因组损伤的方法具有较强的特异性和较高的灵敏度，能够用于快速检测紫外照射后的微生物基因组损伤。

一种检测紫外照射后基因组损伤的方法，通过双通道TaqMan探针荧光定量PCR技术检测微生物基因组损伤，包括以下反应步骤：

步骤1，用相应培养基培养得到所需微生物培养液；