[发明专利]一种检测紫外照射后基因组损伤的方法

权利要求书

1.一种检测紫外照射后基因组损伤的方法，其特征在于，通过双通道TaqMan探针荧光定量PCR技术检测微生物基因组损伤，包括以下反应步骤：

步骤1，用相应培养基培养得到所需微生物培养液；

步骤2，定量取得一定体积所述微生物培养液作为第一培养液，不做额外处理；定量取得一定体积所述微生物培养液作为第二培养液，在一定紫外强度下照射一段时间；

步骤3，向所述第一培养液和第二培养液分别加入裂解原料配制成裂解混合溶液，分别裂解3-10min，在转速6000-10000 rpm下离心5-10 min，获得所述第一培养液和第二培养液的上清液；所述第一培养液上清液作为第一对照组双通道TaqMan探针荧光定量PCR的模板；所述第二培养液上清液作为第一实验组双通道TaqMan探针荧光定量PCR的模板；

步骤4，分别量取定量的步骤3中所述第一对照组的PCR模板，分为相同体积的若干子组并分别加入独立的PCR扩增反应体系中；任一个加入所述第一对照组的模板的PCR扩增反应体系内同时进行长片段和短片段的扩增；所述PCR扩增反应体系组成包括，10X浓度的Taqbuffer、1-5mM的Mg2+盐、0.2-0.4uM的第一探针、0.2-0.4 uM的第二探针、0.2mM的dNTPs、0.2-0.4 uM的短片段引物对P1、0.2-0.4uM的长片段引物对P2、适量的DNA聚合酶及灭菌水；所得各子组PCR扩增反应体系反应产物共同构成所述第一对照组；所述短片段长度为60-300bp；所述长片段长度为1000-2500bp；

步骤5，分别量取定量的步骤3中所述第一实验组的PCR模板，分为相同体积的若干子组并分别加入独立的PCR扩增反应体系中；任一个加入所述第一实验组的模板的PCR扩增反应体系内同时进行长片段和短片段的扩增；所述PCR扩增反应体系组成包括，10X浓度的Taqbuffer、1-5mM的Mg2+盐、0.2-0.4uM的第一探针、0.2-0.4 uM的第二探针、0.2mM的dNTPs、0.2-0.4 uM的短片段引物对P1、0.2-0.4uM的长片段引物对P2、适量的DNA聚合酶及灭菌水；所得各子组PCR扩增反应体系反应产物共同构成所述第一实验组；

步骤6，使用所述双通道探针采集所述第一对照组和所述第一实验组中各子组的荧光信号CT值；

步骤7，所述第一对照组各子组的CT差值计算方法为ΔCTCK=CT长-CT短；所述第一实验组各子组的CT差值计算方法为ΔCTuv = CT长-CT短；根据ΔΔCT= ΔCTuv-ΔCTCK-判断所述第一实验组各子组微生物基因组DNA损伤程度；其中所述ΔCTCK-为第一对照组各子组数值的平均值。

2.根据权利要求1所述的一种检测紫外照射后基因组损伤的方法，其特征在于，步骤2所述紫外照射强度为10-30000uw/cm2；所述照射时间为0.5-100秒。

3.根据权利要求1所述的一种检测紫外照射后基因组损伤的方法，其特征在于，所述裂解混合溶液含有10 mM ph=8.0的Tris-HCL和1%的Triton X-100。

4.根据权利要求1所述的一种检测紫外照射后基因组损伤的方法，其特征在于，所述第一探针特异性作用于所述短片段引物对P1所扩增的片段；所述第二探针特异性作用于所述长片段引物对P2所扩增的片段。

5.根据权利要求1所述的一种检测紫外照射后基因组损伤的方法，其特征在于，还包括：当步骤7所述ΔΔCT≥L时，确定所述第一实验组微生物基因组受到损伤；当ΔΔCTL时，确定所述第一实验组微生物基因组未受到损伤；所述L为检出限L＝(K*s)/b，所述b为最低响应值/循环数，所述K为置信系数，s为第二对照组各子组标准偏差。