[发明专利]一种提高谷氨酸棒杆菌合成5-氨基乙酰丙酸产量的方法

说明书

本发明公开了一种提高谷氨酸棒杆菌合成5‑氨基乙酰丙酸产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明成功实现了敲除α‑酮戊二酸抑制蛋白和琥珀酸脱氢酶以及过表达5‑氨基乙酰丙酸合成酶的重组谷氨酸棒杆菌的构建。采用5‑L发酵罐分批发酵策略，优化发酵条件，最终重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum 13032/△odhI△sdhA/pXMJ19‑hemA发酵84h，在加终浓度4g/L甘氨酸的情况下在48h合成了25.05g/L的5‑ALA，生产率为0.52g/L/h，此时糖酸转化率达到16.79％。实现了5‑氨基乙酰丙酸的高产，获得了以葡萄糖为碳源开始一步发酵的截止目前的最高产量。

技术领域

本发明涉及一种提高谷氨酸棒杆菌合成5-氨基乙酰丙酸产量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid，5-ALA)是很多四吡咯化合物例如血红素、叶绿素、维生素B12前体的一种非蛋白原氨基酸。在诸多领域尤其医药和农业方面有着非常重要的作用。在医药行业，5-ALA目前主要被应用于各种癌症的光动力诊断治疗和多种疾病的肿瘤定位。在农业领域，它被用作一种可生物降解的除草剂、杀虫剂或对作物、动物和人类无毒的生长调节剂。

5-ALA生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。由于化学合成法产量低，又存在严重的环境污染问题，因而不适合大规模的生产。因此，目前国内外主要采用微生物菌株发酵生产5-ALA。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是我国一种短杆或小棒状、无芽孢、无内毒素的革兰氏阳性菌株，在国内的氨基酸生产中被广泛应用。杨等运用分批补料发酵和两阶段发酵的策略，以重组C.glutamicum C4途径最终产生14.7g/L 5-ALA，生产率为0.92g/L/h，这是迄今为止报道的通过C.glutamicum以葡萄糖为原料合成5-ALA的最高产率(具体参见文献Yang P,Liu W,Cheng X,et al.A new strategy for production of5-aminolevulinic Acid in recombinant Corynebacterium glutamicum with highyield.Appl Environ Microbiol,2016,82(9):2709-2717.)，但是，该方法的缺点为需要两阶段发酵，并且培养基成分较复杂，甘氨酸的初始浓度较高，还需要添加琥珀酸。

由于目前发酵生产5-ALA的水平普遍较低，导致5-氨基乙酰丙酸的价格比较的昂贵，并且目前生产5-ALA的产能并不能满足国内需求；因此，提高5-ALA的发酵生产水平非常重要。

发明内容

技术问题

本发明要解决的技术问题是提高5-氨基乙酰丙酸的产量，同时，提高5-ALA的发酵生产水平。

技术方案

为了解决上述技术问题，本发明构建了一种重组谷氨酸棒杆菌，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为宿主，敲除了α-酮戊二酸抑制蛋白odhI和琥珀酸脱氢酶sdhA，并且过表达了5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA。

在本发明的一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌是以pXMJ19质粒或pK18mobsacB质粒为表达载体，过表达了5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA。

在本发明的一种实施方式中，所述α-酮戊二酸抑制蛋白odhI的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述α-酮戊二酸抑制蛋白odhI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述琥珀酸脱氢酶sdhA的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述琥珀酸脱氢酶sdhA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。