[发明专利]具有甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌工程菌

说明书

本发明涉及一种具有优良甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌工程菌株，在简单节杆菌中将3个调控基因单独过表达，或者将调控基因分别和3‑甾酮‑Δ¹‑脱氢酶基因串联后表达，获得了具有优良甾体C1,2脱氢反应能力的工程菌株。在15g/L醋酸可的松(CA)、8％乙醇下，调控单基因过表达菌株生成醋酸泼尼松(PA)的产量较对照菌株提高了16.1％‑23.4％。在45g/L CA、8％乙醇下，调控基因和3‑甾酮‑Δ¹‑脱氢酶基因串联表达菌株的PA生成量较对照菌株提高了48.3％‑68.1％。这种具有优良甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌工程菌株对于提高甾体类化合物转化效率具有重要意义。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有优良甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌工程菌株的构建及其应用。

背景技术：

甾体激素类药物是目前临床用量仅次于抗生素的第二大类药物。甾体C1,2脱氢反应是采用微生物转化法生产甾体药物的典型代表,化合物药理活性在双键引入后成倍增加且副作用减少。

简单节杆菌(Arthrobacter simplex)因专一性高、反应速率快等优点,在工业生产上表现出巨大应用优势。3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(3-Ketosteroid-Δ¹-dehydrogenase，KsdD)是催化该反应的关键酶。目前，研究者多采用增加关键酶表达量的方法构建高效菌株，但随着测序技术和系统生物学的发展，研究者认识到菌株的反应性能还受到胞内其他基因和代谢途径的调控作用。本发明以简单节杆菌催化醋酸可的松生成醋酸泼尼松的过程为对象，基于蛋白质组学技术，筛选得到影响简单节杆菌C1,2脱氢反应能力的调控基因,并通过这些基因的过表达或者这些调控基因与3-甾酮-Δ¹-脱氢酶编码基因的串联表达，构建具有优良甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌工程菌株。

发明内容：

本发明的目的在于挖掘多个能提高简单节杆菌甾体C1,2脱氢反应能力的调控基因，通过调控基因的过表达或者它们与3-甾酮-Δ¹-脱氢酶编码基因的串联表达，构建具有优良甾体C1,2脱氢反应能力的工程菌株。

本发明实现上述目的的技术方案如下：

一株具有甾体C1,2脱氢反应能力的简单节杆菌基因工程菌，其特征在于：基因工程菌是以简单节杆菌CPCC 140451为宿主细胞，过表达序列表SEQ ID No1-3任一所示的调控蛋白编码基因所得。

而且，以pART2A质粒为表达载体，该质粒是在pART2质粒野生型启动子hdnOp的5’端引入限制性酶切位点EcoRV后获得的。

而且，SEQ ID No.7对应的调控蛋白为HYD，其编码基因hyd的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；

而且，SEQ ID No.8对应的调控蛋白为PPS，其编码基因pps的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

而且，SEQ ID No.9对应的调控蛋白为HYP，其编码基因hyp的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；

优选地，所述基因工程菌以pART2A质粒为表达载体。

本发明还提供一种具有优良甾体C1,2脱氢反应能力简单节杆菌基因工程菌株，是在简单节杆菌中串联表达SEQ ID No.7-9所示的调控蛋白和SEQ ID No.10-12任一所示的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶；

而且，SEQ ID No.10对应的关键酶蛋白为红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)SQ1的KsdD1_Re，其编码基因ksdD1_Re的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；