[发明专利]一种检测HIV基因组拷贝数的方法

说明书

本发明涉及一种检测待测样品中HIV基因组拷贝数的方法以及一种数字PCR检测结果的评价方法，本发明还涉及一种试剂盒以及细胞组合的用途。本申请的方法克服了数字PCR存在不稳定结果的问题，能够对数字PCR进行质量控制。

技术领域

本发明涉及生物学，具体涉及一种检测待测样品中HIV基因组拷贝数的方法以及一种数字PCR检测结果的评价方法，本发明还涉及一种试剂盒以及细胞组合的用途。

背景技术

治愈HIV的主要障碍是病毒在血液和不同解剖部位建立稳定的持续感染细胞库。这些库长期存在，可以大致分为两种。在“潜伏库”中，细胞携带着一个完整的病毒基因组，该基因组不表达病毒转录本或蛋白质。这些潜伏的原病毒不受ART影响，也不被免疫系统清除；然而，在刺激后，它们可以恢复到病毒生产状态。目前消除潜伏库的方法就是逆转病毒的潜伏期，从而消除受感染的细胞，这种方法被称为“震杀”。除了潜伏库，“活性库”是一群转录活性细胞，产生HIV-1相关的RNA、蛋白质和可能的病毒粒子，这些可以在艾滋病毒感染者(PWH)中检测到。消除这两种病毒储存库是实现功能性治愈的重点，测量病毒储存库的大小是消除病毒储存库的前提。

HIV-1在活化的CD4+T细胞中复制良好，潜伏感染被认为只发生在静止的CD4+T细胞。当受感染的CD4+淋巴细胞在HIV-1的细胞病变作用下存活，逃避免疫系统并携带完整的前病毒返回到静息记忆状态时，就可能形成一个稳定的病毒储存库。由于记忆细胞的生物学功能是持续很长一段时间，以允许对先前遇到过的抗原再刺激作出反应，而且由于这些细胞中的病毒DNA是稳定整合的，这些潜伏感染的记忆细胞会成为HIV-1的长期病毒储存库。目前，已有人通过测量HIV-1病毒的DNA含量来测量病毒储存库的大小并提供了解释，而且当细胞数量有限时，由于其他方法对定量测量不够敏感，测量HIV-1病毒的DNA含量可能是唯一的化验方法。因为整合后潜伏期被认为是病毒持续存在的主要形式，所以整合HIV-1DNA的含量水平会提供比较准确的病毒库大小的测量结果。

然而，当前可用的数字PCR平台都会受到假阳性分区的影响(Bosman KJ,NijhuisM,van Ham PM,Wensing AMJ,Vervisch K,Vandekerckhove L,et al.Comparison ofdigital PCR platforms and semi-nested qPCR as a tool to determine the size ofthe HIV reservoir.Sci Rep.2015；5:13811.)，例如在国外研究者的一次HIV-1RNA检测中，每3孔阴性对照中就有1孔有2～3个阳性液滴。当检测HIV-1DNA含量更低的样本时，这种影响会更大，比如PBMCs、全血、干血点或组织活检。并且，在该文献中还提到，假阳性会导致将待测样本确认为HIV感染样本的错误结果，并继续进行ART(抗反转录病毒治疗)，如果意欲区分待测样本中是否存在HIV DNA，则不建议使用数字PCR。

因此，为了解决上述问题，本申请意在提供一种能够利用数字PCR稳定、准确检测HIV-1基因组拷贝数的方法。

发明内容

本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，解决了数字PCR中存在的结果不稳定问题。分别对细胞计数和数字PCR的检测结果进行相关性分析，获得了准确的检测结果。

因此，在第一方面，本申请提供了一种检测待测样品中HIV基因组拷贝数的方法：

(a)提供含有单拷贝HIV基因组的细胞以及待测样品，提取所述细胞中的核酸以及待测样品中的核酸，将所述细胞中的核酸称为第一核酸，将所述待测样品中的核酸称为第二核酸；

(b)通过数字PCR检测第一核酸和第二核酸的拷贝数；

(c)对所述细胞进行计数；

(d)计算细胞计数的数值与第一核酸的拷贝数的数值的比值；当所述比值处于0.7至1.3的范围内时，获得的第二核酸的拷贝数即为HIV的拷贝数。