[发明专利]合成α-熊果苷的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种合成α‑熊果苷的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，本发明提供了能稳定且高效生产α‑熊果苷的基因工程菌株的构建方法，通过引入蔗糖磷酸化酶的优化的RBS^opt序列，并将蔗糖磷酸化酶的表达框整合至基因组上，显著提高了α‑熊果苷在胞外的积累量，最高浓度可达119.44g/L，底物HQ的摩尔转化率为96.56％，为实现α‑熊果苷的工业化生产奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌的构建方法简便易行，菌株构建完成后生产性能稳定，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种合成α-熊果苷的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

α-熊果苷(α-arbutin)的化学名为4-羟苯基-α-D吡喃葡萄糖苷，是目前国际上公认的安全有效的美白物质，由葡萄糖与氢醌通过α-糖苷键连接而成。由此可以看出，α-熊果苷的分子结构由两部分功能团组成：亲水性的葡萄糖残基和能够抑制黑色素合成酶活性的酚基。α-熊果苷与其异构体β-熊果苷相比，具有更优越的美白效果和更高的人体安全性；此外，α-熊果苷的稳定性更强，可以较为方便地添加至多种类型的美容用品中。因此，α-熊果苷具有广阔的应用前景和市场，极具工业化价值。

α-熊果苷的合成可以通过化学合成法、植物提取法和生物转化法这三类方法实现，其中，生物转化法又可细分为酶催化法和全细胞催化法两种。生物转化法与前两种方法相比，虽然具有反应温和、操作简便、绿色环保等突出的优势，但普遍面临着转化率低、产量不稳定等问题。目前，应用于美容用品中的α-熊果苷主要是由日本的江琦格力高公司通过酶转化的方法获得；而国内对于α-熊果苷制备的研究较少，面对巨大的市场需求，亟待实现α-熊果苷的工业化生产。

目前被研究可用于催化合成α-熊果苷的酶主要有α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖异构酶、淀粉蔗糖酶、环糊精葡萄糖基转移酶。这些酶利用不同的底物进行转糖基化反应生产α-熊果苷，但不同酶的产物转化能力各不相同。其中，蔗糖磷酸化酶(EC2.4.1.7)发生转糖基化作用时，对于糖基供体底物有着严格的特异性要求：仅能以蔗糖、葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-1-氟化物作为底物；另一方面，蔗糖磷酸化酶对受体底物的特异性要求很低：糖、糖醇、酚类物质、羟基化合物及某些羧酸化合物均可作为受体底物。

在过去的研究中，为了大量获得蔗糖磷酸化酶，研究人员往往采用高拷贝质粒游离表达目的基因。但由于高拷贝质粒在细胞内容易丢失，导致细胞的生产性能不稳定，难以实现工业化应用。而后，有研究尝试将蔗糖磷酸化酶整合表达，以稳定细胞的生产性能。但α-熊果苷的产量及底物利用率仍有较大的提升空间。

发明内容

为了稳定且高效地生产α-熊果苷，我们对蔗糖磷酸化酶基因smut的RBS序列进行了优化，提高了枯草芽孢杆菌生产α-熊果苷的能力，具有重要的经济价值和工业化意义。

本发明的第一个目的是提供一种合成α-熊果苷的枯草芽孢杆菌，其是在枯草芽孢杆菌宿主中整合表达蔗糖磷酸化酶，并采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的RBS调控蔗糖磷酸化酶基因表达。

进一步地，所述的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述的整合表达是在枯草芽孢杆菌宿主的yqhB位点、yitR位点和ymzB位点中的一个或多个位点整合包含蔗糖磷酸化酶基因的表达框。

进一步地，所述的枯草芽孢杆菌宿主为枯草芽孢杆菌WB800ΔnprB-ΔaprE-Δepr-Δbpr-ΔnprE-Δmpr-Δvpr-ΔwprA。是在WB800基础上敲除中性蛋白酶nprE、碱性蛋白酶aprE、胞外蛋白酶epr、金属蛋白酶mpr、杆菌肽酶bpr、中性蛋白酶nprB、细胞壁结合蛋白wprA及vpr基因。

本发明的第二个目的是提供所述的枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：