[发明专利]重组微生物及其用途、制备莽草酸和奥司他韦的方法

说明书

本发明涉及用于生产莽草酸的重组微生物、该微生物在制备莽草酸中的用途、制备莽草酸的方法和制备奥司他韦的方法。所述重组微生物的PTS系统和莽草酸激酶被下调，并且所述重组微生物的3‑脱氢奎尼酸合成酶、3‑脱氢奎尼酸脱水酶、3‑脱氧‑D‑阿拉伯庚酮糖‑7‑磷酸合成酶、莽草酸脱氢酶、转酮醇酶I、磷酸烯醇式丙酮酸合成酶被上调，其中，所述重组微生物进一步携带编码下列至少之一的外源核酸：(A)外源肌醇转运蛋白或其功能类似物；和(B)外源葡萄糖转运蛋白或其功能类似物。利用该重组微生物能够有效地生产莽草酸。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的，本发明涉及用于生产莽草酸的重组微生物、该微生物在制备莽草酸中的用途、制备莽草酸的方法和制备奥司他韦的方法。

背景技术

莽草酸(shikimic acid，在本文中有时简称为“SA”)是一种小分子有机酸，其具有下列化学结构：

莽草酸是多种重要化合物的关键中间体，例如芳香族氨基酸、泛酸、叶酸和维生素K12等芳香族化合物。另外，莽草酸是合成某些吲哚衍生物、生物碱和某些手性(如抗病毒药物)的重要前体，具有广泛的药用价值。目前，莽草酸也是合成抗病毒药物磷酸奥司他韦(达菲)的关键中间体。

在2005年世界禽流感大规模爆发时，以及H7N9型禽流感爆发期间，达菲对这些高致病性流感病毒均表现出了良好的治疗效果，被作为特效药身价倍增，莽草酸作为合成磷酸奥司他韦的前体，也因此备受关注。据相关数据显示，2014年全球达菲销售市场达10.50亿美元。而莽草酸的市场售价可从平时的$40/kg上涨至禽流感爆发时的$1,000/kg，而高纯度SA价格更是高达$50/g。由此可知，莽草酸的市场规模和销售前景是非常大。

莽草酸广泛存在于多种植物中，在木兰科植物八角茴香中含量较高，可达成熟干重的10％。野生八角中莽草酸含量较高，是很好的植物提取来源，所以现多采用可食用的八角进行工业提取。但由于其分布较为狭窄，仅在我国广西、福建等地区和越南部分地区分布，来源较为单一且具有季节性。另外，植物提取生产工艺复杂，得率较低，原料易受季节气候等因素限制，产量及价格波动较大，难以满足大规模生产需求。

莽草酸及其类似物也可通过化学方法合成，奎宁酸转化法则以奎宁酸衍生物和2,2-二甲基丙烷作为原初物质进行合成，其总收率最高可达62％。化学法虽然收率和纯度较高，但受原料来源限制，生产成本过高和化学废物难处理等因素的制约，并未得到广泛应用，因此，利用微生物来生产莽草酸具有极广阔的应用前景。

虽然已有诸多学者在大肠杆菌中构建莽草酸的表达途径，但部分菌株的表达需要IPTG和变温诱导，增加了大规模生产的成本与难度，且都未能够突破生产效率的瓶颈，也并未进行工业实验，仅停留在实验室阶段，离工业化应用尚有较大差距。由此，目前利用基因工程改造微生物合成莽草酸的手段仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。由此，本发明提出了一种能够有效提高生产莽草酸效率，尤其是对于大体积液体发酵生产莽草酸能够有效提高生产效率的重组微生物。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种用于生产莽草酸的重组微生物，根据本发明的实施例，所述重组微生物的PTS系统和莽草酸激酶被下调，并且所述重组微生物的3-脱氢奎尼酸合成酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶、莽草酸脱氢酶、转酮醇酶I、磷酸烯醇式丙酮酸合成酶被上调，其中，所述重组微生物进一步携带编码下列至少之一的外源核酸：(A)外源肌醇转运蛋白或其功能类似物；和(B)外源葡萄糖转运蛋白或其功能类似物。根据本发明的实施例，利用该重组微生物能够有效地生产莽草酸。

根据本发明的实施例，上述重组微生物还可以进一步具有下列附加技术特征的至少之一：

根据本发明的实施例，编码所述外源肌醇转运蛋白的外源核酸为iolT1和iolT2的至少之一。