[发明专利]一种用于检测MTRR基因和MTR基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法

说明书

本发明涉及分子检测领域，尤其涉及一种用于检测MTRR基因和MTR基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法。本发明针对MTRR基因和MTR基因多态性在MTRR基因的66位点和MTR基因的2756位点设计特异性引物，并且选用看家基因GAPDH作为内参作为检测这两个位点多态性的引物组合。在检测时，将引物组合分为突变型检测体系和野生型检测体系，设置检测位点和内参的荧光值差异的阈值，通过突变型检测体系和野生型检测体系中的荧光值差异判断待测样本在MTRR基因的66位点和MTR基因的2756位点的基因型，进而可以快速、准确地判断MTRR基因的66位点和MTR基因的2756位点的多态性。

技术领域

本发明涉及分子检测领域，尤其涉及一种用于检测MTRR基因和MTR基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法。

背景技术

叶酸是由喋呤啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸等组成的一种水溶性B族维生素，由于其最早由菠菜叶中分离而得，故称为叶酸。在人体中的叶酸以活性物质四氢叶酸的形式作为一碳单位的传递者，为体内物质，如碱基的合成及核酸和蛋白质的甲基化提供甲基原料，从而参与许多化合物的生成和代谢。在叶酸-甲硫氨酸循环代谢途径中，MTR(甲硫氨酸合成酶)和MTRR(甲硫氨酸合成酶还原酶)发挥着重要作用。

MTR在代谢途径中可以催化同型半胱氨酸再甲基化形成甲硫氨酸，该催化过程需要有甲基类维生素B12的帮助，同时需要MTRR的还原作用，使其保持催化活性。MTR基因位于染色体1q43，基因全长约105.2kb，转录的mRNA全长约7122nt，含有33个外显子，编码1265个氨基酸残基组成的蛋白质。一般都将MTR基因突变作为G型甲基维生素缺乏症的主要致病原因，其中位点A2756G是最主要和研究最多的突变。

MTRR是具有电子转移作用的铁氧化还原蛋白-NADP(+)还原酶(ferredoxin-NADP(+)reductase，FNR)的家族成员。该酶在叶酸-甲硫氨酸循环代谢途径中通过还原作用使MTR重新具有功能活性。MTRR基因位于5p15.3-p15.2，基因全长约32,021kb，转录的mRNA全长3,274nt，含有15个外显子，编码726个氨基酸残基组成的蛋白。MTRR基因突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏症E型的主要病因，也是同型半胱氨酸、叶酸代谢异常的主要病因之一，其中基因突变A66G是研究最主要和最多的。

MTR和MTRR在叶酸代谢循环过程中起关键作用，如果发生基因突变，合成的酶会出现酶缺陷或酶活性下降，甲基的传递作用下降，甲硫氨酸的合成就会受到阻碍，从而引发一系列的病变。首先，甲基化作用的降低，影响体内碱基、核酸和蛋白质等物质的合成，影响很多代谢过程；其次，甲硫氨酸合成功能的降低导致了体内的同型半胱氨酸堆积，血液中高浓度的同型半胱氨酸能损害血管的内皮细胞，成为重要的心脑血管致病因素；同时，高浓度的同型半胱氨酸作用于敏感的胚胎神经细胞，可造成无脑畸形和脊柱裂等不可逆损害；最后，同型半胱氨酸溶解性小，易于在泌尿系统形成结石。因此，MTR基因和MTRR基因突变应引起广泛的关注。

目前，对基因突变位点的检测，主要是利用特异性荧光探针法和熔解曲线法。特异性荧光探针法利用特异性的探针，对目标序列进行检测，该方法的特异性很高，但对于探针的设计要求很高，而且合成探针的费用也较高。熔解曲线的方法，虽然快速、准确，但是对于扩增仪的温控要求非常高，一般的仪器无法满足要求。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种用于检测MTRR基因和MTR基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法。

第一方面，本发明提供一种用于检测MTRR基因和MTR基因多态性的引物组合，包括：

MTRR 66A上游引物：5’-GCCATCGCAGAAGAACTA-3’(SEQ ID NO.1)，

MTRR 66G上游引物：5’-GCCATCGCAGAAGAACTG-3’(SEQ ID NO.2)，