[发明专利]牛乳中细菌总数快速定量检测方法及试剂盒

说明书

本发明涉及牛乳中细菌总数快速定量检测方法及试剂盒，使用绿色荧光探针通过化学基团交联的革兰氏阴性菌的抗体和革兰氏阳性菌的抗体，分别标记样品中的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌；使用可以膜阻隔性红色荧光核酸探针对死菌总数进行标记。通过流式分析仪同时计数红色和绿色荧光信号，实现细菌总数的快速定量检测。本发明的试剂盒具有准确定量、检测时间短、可区分死菌和活菌的优点。

技术领域：

本发明属于食品微生物快速检测领域，涉及牛乳中细菌总数的快速定量检测，特别是一种基于荧光探针通过化学基团交联的抗体标记和流式分析技术快速定量检测活菌总数的方法及检测试剂盒。

背景技术：

随着国内生活水平的提升，牛乳的消费量呈逐年上升的趋势，但同时也面临着食品安全方面的威胁。菌落总数是国标GB 19301《食品安全国家标准生乳》和GB 19645《食品安全国家标准巴氏杀菌乳》重要指标之一。

目前，牛乳中微生物的检测主要依靠常规的细菌学培养方法，然而培养方法耗时费力，也导致了检测结果的滞后性,也无法适应大规模筛查检测的需求。给企业生产和质量监管带来了极大不便,甚至经济损失。因此传统的微生物学培养方法愈来愈难以满足快速精确的牛乳中微生物检测的需求，因此，研究建立快速、准确、灵敏的菌落总数检测方法，将在食品安全监控中起重要的作用。

流式分析技术在细菌检测领域有着快速、高效的优点。其用于致病菌检测的研究也愈加受到重视。然而，目前基于流式分析技术的特异性检测牛乳中获得细菌总数快速检测的成熟方法少之又少。

发明内容：

本发明的第一目的是提供一种牛乳中细菌总数的快速定量检测方法，尤其是要满足以下要求：1、必须能够区分细菌和杂质；2、能够定量测量细菌总数；3、必须能够区分死菌和活菌；4、快速得到检测结果。

本发明的第二目的是提供能达到上述目的的检测试剂盒。

本方法具有一个技术关键点：如何特异性区分所有细菌与牛乳中的体细胞和其它杂质。

众所周知，细菌分为革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。因此，本发明特制备出针对革兰氏阴性细菌菌体表面脂多糖特征结构抗原类脂A抗体和针对革兰氏阳性细菌菌体表面特征结构抗原磷壁酸抗体，并将绿色荧光探针分别偶联在所述类脂A抗体和所述磷壁酸抗体上，制备成细菌特异性荧光探针。

同时，本发明还筛出膜阻隔性红色荧光核酸探针区分死菌与活菌。通过荧光标记牛乳中的细菌，然后采用流式分析技术对细菌进行多参数检测，从而实现了牛乳中活的细菌总数的快速、定量分析。

针对上述问题，本发明人进行了如下工作：

1、制备能识别所有革兰氏阴性细菌的抗体

采用了偶联有绿色荧光探针的革兰氏阴性细菌的抗体，对革兰氏阴性细菌进行特异性荧光标记，并使用流式分析仪对革兰氏阴性细菌的荧光进行分析。

2、制备能识别所有革兰氏阳性细菌的抗体

采用了偶联有绿色荧光探针的革兰氏阳性细菌的抗体，对革兰氏阳性细菌进行特异性荧光标记，并使用流式分析仪对革兰氏阳性细菌的荧光进行分析。

适用于流式分析仪的革兰氏阴性细菌抗体和革兰氏阳性细菌抗体筛选十分困难：第一，革兰氏阴性细菌种类繁多。适用的抗体需能够特异性识别所有革兰氏阴性细菌菌株。然而目前，尚未有人筛选得到这样的抗体。第二，革兰氏阳性细菌种类繁多。适用的抗体需能够特异性识别所有革兰氏阳性细菌菌株。然而目前，尚未有人筛选得到这样的抗体。第三，市面上常见的抗体主要用于ELISA，IHC-Fr，WB等实验。这些实验中，抗原抗体主要在固定相上进行反应，比如反应板。而流式分析技术中，抗原抗体的反应都在流动相中进行。因此流式分析技术需要亲和性好的抗体。