[发明专利]牛乳中细菌总数快速定量检测方法及试剂盒

权利要求书

1.以下革兰氏阴性菌的抗体和革兰氏阳性菌的抗体在检测牛乳中细菌总数中的应用；

所述革兰氏阴性菌的技术指标如下：

a制备所述抗体所用免疫原为革兰氏阴性细菌菌体表面脂多糖中的类脂A；

b所述抗体可以在流动相内与革兰氏阴性细菌发生反应；

c所述抗体经过绿色荧光探针交联后，能够对革兰氏阴性细菌进行荧光标记，且荧光可以被荧光显微镜和流式分析仪观察到；

d所述抗体与类脂A的亲和力KD应小于2×10^-10；

e所述抗体能够识别所有的革兰氏阴性细菌。

所述革兰氏阳性菌的抗体的技术指标如下：

a制备所述抗体所用免疫原为革兰氏阳性细菌菌体表面的磷壁酸；

b所述抗体可以在流动相内与革兰氏阳性细菌发生反应；

c所述抗体经过绿色荧光探针交联后，能够对革兰氏阳性细菌进行荧光标记，且荧光可以被荧光显微镜和流式分析仪观察到；

d所述抗体与磷壁酸的亲和力KD应小于2×10^-10；

e所述抗体能够识别所有的革兰氏阳性细菌。

2.一种快速定量检测牛乳中细菌总数的方法，其特征如下：

1)识别样品中的革兰氏阴性细菌：使用绿色荧光探针通过化学基团交联的革兰氏阴性菌的抗体，标记样品中的革兰氏阴性细菌；

2)识别样品中的革兰氏阳性细菌：使用绿色荧光探针通过化学基团交联的革兰氏阳性菌的抗体，标记样品中的革兰氏阳性细菌；

3)区分样品中的死菌和活菌：使用可以膜阻隔性红色荧光核酸探针对死菌总数进行标记；

4)通过流式分析仪同时计数1)、2)和3)产生的绿色和红色荧光信号，实现细菌总数的快速定量检测；

上述1)和2)中，所述革兰氏阳性菌的抗体和所述革兰氏阴性菌的抗体如权利要求1所述；

上述4)中，细菌总数的判定方法如下：对于一个颗粒产生的事件，如果仅检测到绿色荧光，则判定为活菌；如果同时检测到红色和绿色两种荧光，则判定死菌；如果未检测到荧光，则判定为杂质颗粒。

3.权利要求2所述的方法，所述通过流式分析仪计数，是通过流式分析仪的散射光通道进行圈门，并通过双荧光通道检测所述红色和绿色荧光信号，从而检测细菌总数；其中，前向角散射光通道的圈门在500nm到2500nm之间。

4.权利要求3所述的方法，所述圈门，其方法为：使用流式分析仪测量500nm标准微球和2500nm标准微球，在前向角散射光通道的直方图上，根据微球的信号位置进行圈门，下限在500nm，上限在2500nm。

5.权利要求2所述的方法，所述绿色荧光探针的荧光发射光谱在501nm～540nm。

6.权利要求2所述的方法，所述红色荧光探针的荧光发射光谱在601nm～640nm。

7.权利要求2所述的方法，所述流式分析仪的技术指标和检测参数是：荧光灵敏度10MESF，散射光灵敏度50nm，荧光分辨率RSD3％，散射光分辨率3％；分析速度为1～30μL/min，检测时间为15～300s。

8.权利要求2～7任一所述的方法，待检样品进行检测之前需要进行纯化处理；所述纯化，方法是将牛乳中加入蛋白酶和表面活性剂，去除蛋白质和脂肪，得到纯化的样品菌悬液。

9.一种牛乳中细菌总数快速定量检测试剂盒，其特征是具有：

绿色荧光探针交联的革兰氏阴性菌的抗体，可以识别样品中的革兰氏阴性细菌；

绿色荧光探针交联的革兰氏阳性菌的抗体，可以识别样品中的革兰氏阳性细菌；

膜阻隔性红色荧光核酸探针；

校准微球(500nm和2500nm)。

所述革兰氏阴性菌的抗体和所述革兰氏阴性菌的抗体如权利要求1所述。

10.权利要求9所述的试剂盒，所述红色荧光探针的荧光发射光谱在601nm～640nm；所述绿色荧光探针的荧光发射光谱在501nm～540nm。