[发明专利]一种检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒及应用

权利要求书

1.一种检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒，其特征在于：包括如SEQ ID NO.1所示的引物RT-RPA-F-1、如SEQ ID NO.2所示的引物RT-RPA-R-1和如SEQ ID NO.3所示的引物探针RT-RPA-P-1。

2.根据权利要求1所述的检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒，其特征在于：还包括MMLV逆转录酶、nfo试剂、水和一次性防污染核酸检测装置中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒，其特征在于：所述的nfo试剂包括用于RPA扩增的酶、用于RPA扩增的缓冲液和乙酸镁中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒，其特征在于：

所述的用于RPA扩增的酶包括能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶；

所述的用于RT-RPA扩增的水为双蒸水或超纯水。

5.根据权利要求2所述的检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒，其特征在于：所述的一次性防污染核酸检测装置包括一体化检测装置、用于核酸检测的侧流层析试纸条和装有检测缓冲液的滤泡。

6.根据权利要求1所述的检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒，其特征在于：所述的柯萨奇病毒A组6型可视化核酸检测试剂盒包含预混液，预混液包含引物RT-RPA-F、引物RT-RPA-R和探针RT-RPA-P；引物RT-RPA-F、引物RT-RPA-R和探针RT-RPA-P按摩尔比7：7：2配比混合。

7.根据权利要求6所述的检测柯萨奇病毒A组6型核酸的可视化试剂盒，其特征在于，所述的引物和探针的浓度以最终使用时各成分的终浓度如下计算：引物RT-RPA-F 0.42μM，引物RT-RPA-R 0.42μM，探针RT-RPA-P 0.12μM。

8.权利要求1～7任一项所述的可视化试剂盒的应用，其特征在于包括如下步骤：

(1)对待检测样本提取总RNA；

(2)配制RT-RPA扩增反应体系，每50μL反应体系的组成如下：0.5μL MMLV逆转录酶100U/μL、1管nfo干粉试剂、用于RT-RPA扩增的缓冲液29.5μL、浓度为10μM的引物RT-RPA-F和RT-RPA-R各2.1μL、浓度为10μM的探针RT-RPA-P 0.6μL、总RNA 3μL，用于RPA扩增的水补足至47.5μL；

(3)加入浓度为280mM的乙酸镁2.5μL，混匀后立即于37～42℃条件下进行RT-RPA扩增反应5～40min；

(4)检测：将经过扩增的PCR反应管放入一次性核酸检测装置，再合上检测装置，等待5～15min，最后判读结果；

(5)结果判读：

每批次实验必须同时做阳性对照、阴性对照和空白对照，三种对照完全符合后才能确认结果的可靠性；

a)若只是试纸条的对照条带显色，检测结果为阴性；

b)若试纸条的对照条带和检测条带同时显色，检测结果为阳性；

c)若试纸条的对照条带不显色，重复进行试验。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的待检测样本包括粪便、肛拭子、咽拭子、脑脊液、血清或疱疹液中的至少一种。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：步骤(3)中所述的RT-RPA扩增反应的条件为温度是37℃，时间是35min。