[发明专利]一种制备长分子测序DNA的方法

权利要求书

1.一种制备长分子测序DNA的方法，包括以下步骤：

1)改变小DNA片段的末端：将小DNA片段的突出末端变为平末端，然后在平末端增加额外的单碱基凸起；

2)添加接头：向步骤1)处理后的小DNA片段中加入设计好的带有与处理后的小DNA片段单碱基凸起配对互补的接头；所述接头为一段寡核苷酸片段，该寡核苷酸片段与其互补寡核苷酸片段配对后形成的双链两端均带有单碱基，该单碱基与步骤1)处理后的小DNA片段的单碱基凸起互补配对；

3)串联小DNA片段：通过添加的接头，首尾连接小DNA片段，将小DNA片段串联成长分子测序DNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)给小DNA片段增加额外的单碱基凸起为dA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)利用T4 DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、多核苷酸激酶、ATP和dNTP的混合物，在水溶液中修改小DNA片段，用dA给DNA加尾；孵育后，加热来终止反应混合物，使小DNA片段3’端留下单碱基A的尾巴。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接头为2-20个碱基的寡核苷酸片段，自身具有回文结构、发夹结构或茎环结构。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述接头的5’端磷酸化作为限制酶位点，和/或，所述接头序列在中心区域用dU进行修饰。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)加入接头后，加入DNA连接酶与连接缓冲液，4～50℃孵育，接头连接后酶失活，完成连接接头与小DNA片段串联。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述小DNA片段为细胞内DNA分子在细胞外裂解或降解后的片段。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述小DNA片段碱基长度为130bp-400bp。

9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，将制备长分子测序DNA的反应原料直接全部混合，将混合物乳化成水油微滴，将在水油微滴置于微滴PCR设备或微流体芯片内进行反应。

10.一种测序方法，包括权利要求1-9任一所述的方法，将制备的长分子测序DNA进行测序分析。