[发明专利]一种获得片段化DNA单链池的方法及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，本发明公开了一种获得片段化DNA单链池的方法及其应用。本发明利用只有一条靠近待检测位点的引物且在ddNTPs存在的情况进行PCR扩增片段化DNA，产生长度较短的末端带有一个ddNTP的DNA单链池，使得扩增的片段长度集中在80‑120nt，对比不加ddNTPs的方法，本发明使得片段化DNA更充分更全面地扩增出带有待检测位点的短的单链DNA片段，产生的片段长度更短，长度分布更窄。同时在后续的应用Blocker介导的锁式探针技术以及其他杂交探针进行片段化DNA的检测时，检测更准确和更灵敏，能够应用于片段化DNA的相关检测中。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种获得片段化DNA单链池的方法及其应用。

背景技术

癌症是临床上常见的恶性肿瘤，这个疾病进展快死亡率高，对患者身体心理经济上造成了巨大的危害，也是大家比较关注的公共卫生问题。近几十年，癌症的诊断是一直研究的热点话题，2013年，《Nature》刊登了一篇证实绝大部分人类所患的癌症，都由21个主要的基因突变引成的论文，至此，基因检测成为了癌症治疗及预防的重要手段。通过基因检测，我们可以把人体这些变异的基因找出来，根据基因检测的结果再“因人而异”选择化疗药物或分子靶向治疗药物，从而实现癌症的个性化治疗。

在基因检测中，cfDNA的检测、监测和分子研究为早期疾病的检测提供了一种有意义的、无创的方法。目前，人体体液中循环的片段化的DNA(Circulating cell-free DNA,cfDNA)作为非侵入性筛查和诊断的遗传物质得到众多科学家及临床医生的关注。FernandoM R和其同事发现在血浆中包含76bp,135bp,490bp和905bp的DNA分别占比100％、39％、18％、5.6％，说明这些游离的DNA是高度片段化的。但高度片段的DNA对于目前已有的核酸检测技术具有很大的挑战性。

目前大多数的检测方法都是检测单链DNA(ssDNA)的基因突变，而外周血中的cfDNA是片段化的双链DNA(dsDNA)，所以尽可能更完全的扩增出带有检测位点的cfDNA片段的单链形式是较为关键的工作。

当前，获取ssDNA的方法可以用Lambda外切酶降解法，即首先用一条磷酸化的引物和一条普通的引物进行典型PCR扩增得到双链产物，随后加入Lambda外切酶(识别磷酸基团并将带有磷酸基团的那条链逐一降解成单个核苷酸)进行降解，最后得到单链DNA。但该方法获取cfDNA的单链时会丢失部分样本，这是因为cfDNA是高度片段化，目前科学家们对其了解甚少，仅仅知道其长度的分布范围，但基因组在片段化的位置不确定。传统PCR无法设计出一组引物可以获取所有种类的cfDNA片段单链。故当某一条cfDNA片段，如果不能同时包含两条引物的结合序列时，则无法完成PCR过程，进而无法得到这条cfDNA的单链形式，在后续的检测中，这条cfDNA所携带的遗传信息丢失。

并且当以cfDNA为模板时，目前常规的获得单链池的方法比如不对称PCR可能会扩增出一条很长的单链，是多种cfDNA片段的结合(扩增出长链是因为每一轮产生的产物都可以作为随后每轮的引物，所以就会和片段化的cfDNA中的多种片段结合，生成长链)。而较长的ssDNA很容易形成二级结构，将降低后期检测方法的灵敏度和精准度。

综上，使用Lambda外切酶降解法这种普通PCR方法得到的cfDNA单链，无法展现多种片段化cfDNA待检测位点的所有遗传信息，且容易生成具有复杂二级结构的副产物，最终降低后续检测方法的灵敏度和精准度。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种获得片段化DNA单链池的方法，使得所述方法能够展现出多种片段化单链DNA形式，避免片段化单链DNA待测位点的丢失；同时，获得的片段化单链DNA长度较短，不容易形成二级结构；

本发明的另外一个目的在于提供上述方法在检测片段化DNA单位点变异中的应用；