[发明专利]一种定量检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物及方法

说明书

本发明公开了一种定量检测转基因大豆ZH10‑6的特异性引物，它是采用一对特异性的引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，并在PCR反应体系中添加荧光标记的探针对PCR反应过程进行实时监测，在60℃左右对核酸进行扩增，通过稀释标准品制作标准曲线，利用内参校正转基因耐除草剂大豆ZH10‑6转化体序列的百分含量，对未知样品进行相对定量检测。其结果鉴定采用扩增曲线是否起峰及起峰的循环数判断扩增与否，利用标准品制作的标准曲线相对定量未知样品百分含量。本发明的检测方法具有高特异性、高灵敏度、快速、简便等优点，为转基因耐除草剂大豆ZH10‑6的定量检测提供了可行的方法。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及一种转基因产品的检测方法，具体说是一种基于实时荧光PCR的定量检测转基因大豆ZH10-6的方法，通过标准品制作标准曲线，利用内源基因校正外源种属特异性基因对转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列进行定量检测的方法。

背景技术

根据农业生物技术应用国际服务组织ISAAA最新统计显示，2018年全球有26个国家种植了1.917亿hm²转基因作物，其中转基因大豆以9590万hm²种植面积居首，占全球转基因作物种植面积的50%；从单一作物的种植面积来看，2018年转基因大豆的应用率为78%；共有31个国家/地区批准了38个转基因大豆转化体，主要包括GTS 40-3-2、MON89788、A2704-12、MON88017等转化体。中国是巴西大豆的主要出口市场，在2018年，巴西80%的大豆出口到中国，出口总额预计达到830亿kg，创历史新高。而转基因大豆的研发在国内外均占据举足轻重的地位。

转基因耐草甘膦大豆ZH10-6是由中国农业科学院作物科学研究所研发的转G2-EPSPS基因和GAT基因耐除草剂大豆新品系。研发人采用农杆菌介导转化法，将整合有G2-EPSPS和GAT两个基因的独立表达载体DNA导入大豆受体中，通过多代筛选获得对草甘膦具有抗性的ZH10-6转化体，在中国具有重要产业化应用前景。

基于Taqman水解探针的实时荧光PCR方法，是指通过特异性的引物扩增目的基因序列，通过在体系中添加荧光标记的水解探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步，从而实现对反应过程的实时监测。

相对于转基因成分定性PCR检测方法，实时荧光定量PCR检测方法不仅可以检测出产品含有的转基因成分，而且可以相对定量出所含转基因成分的含量，更加有利于转基因产品的管理。目前，多种转基因植物均有其实时荧光PCR检测方法，例如李葱葱等建立了转基因玉米Bt176的实时荧光定量检测方法；汪秀秀等建立了针对转基因棉花GHB119品系的特异性实时荧光PCR定量检测方法。

中国已经研制了ZH10-6大豆的定性PCR检测方法标准，但是其实时荧光定量PCR方法未见报道，建立本转基因耐除草剂大豆ZH10-6实时荧光定量PCR检测方法，以便对转基因大豆ZH10-6转化体进行定量研究。本研究以ZH10-6转化体特异性序列为靶标，依据相关技术要求，建立了基于Taqman水解探针的实时荧光定量PCR检测方法，将对该转化体的安全评价、行政监管和知识产权保护提供重要的技术支撑。

发明内容

本发明克服了普通PCR检测转基因大豆ZH10-6只能定性不能定量的技术缺陷，提供一种定量检测转基因大豆ZH10-6的方法。本发明的目的是解决定量检测转基因大豆ZH10-6方法空缺的问题，具有简单易行、灵敏度高、特异性强、稳定的优点。

本发明的技术内容如下：