[发明专利]一种定量检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物及方法

权利要求书

1.一种定量检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物，其特征在于包括ZH10-6的第二个5’端外源基因插入侧翼的序列如下：

正向引物序列：5’- CAAATCCTATGGGCATTCTTCC -3’

反向引物序列：5’- CTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATC-3’

探针序列：FAM-CACCTTCTGGCTCCTTCAAACACTG-BHQ1

内源基因Lectin基因序列：

正向引物序列：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’

反向引物序列：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’

探针序列：FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1。

2.一种采用权利要求1所述的特异性引物进行快速定量检测方法，其特征在于如下步骤：

（1）实时荧光定量PCR检测方法的特异性引物，其特征在于

正向引物序列：5’-CAAATCCTATGGGCATTCTTCC-3’,

反向引物序列：5’- CTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATC-3’，

探针序列：FAM-CACCTTCTGGCTCCTTCAAACACTG-BHQ1；

内源基因Lectin基因序列：

正向引物序列：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’，

反向引物序列：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’，

探针序列：FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1；

（2）实时荧光定量PCR反应体系：总体积20 μL，包括TaKaRa 2×Premix Ex Taq (probeqPCR) 10 μL，上下游引物(10 µmol/L)各1 μL，探针(10 µmol/L) 0.5 μL，DNA模板(25 ng/μL) 2 μL, 用无菌水补充至20 μL；

（3）实时荧光定量PCR反应扩增程序：95℃预变性10 min, 1个循环；95℃变性10 s, 60℃退火30 s, 40个循环；

（4）构建转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列定量检测的标准参照物，提取转基因耐除草剂大豆ZH10-6的基因组DNA后，进行梯度稀释，分别得到100%、20%、4%、0.8%、0.16%、0.032%、0.0064%、0.00128%8个浓度的DNA，利用8个浓度梯度的DNA为模板进行实时荧光PCR扩增，分别构建转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列和内源基因Lectin基因的标准曲线；

（5）设定阈值后，荧光定量PCR仪的数据分析软件自动计算每个反应的Ct值和靶标浓度，并记录，按照公式A=B/[B+(C-B)/D]×100%，计算出试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列百分含量，式中A为转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列百分含量，B为转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体序列的靶标浓度，C为Lectin内源基因的靶标浓度，D为转基因大豆ZH10-6成分中掺入非转基因大豆成分的校正系数，即为转基因大豆ZH10-6基因组大小/掺入非转基因大豆基因组大小。

3.权利要求1所述定量检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物在用于ZH10-6快速定量高效筛查方面的应用。