[发明专利]结缕草AFLP分子指纹图谱库的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种引物对组合，本发明还公开了所述引物对组合在结缕草种质鉴别或品种鉴定或AFLP分子指纹图谱库的构建中的应用。本发明还公开了一种结缕草AFLP分子指纹图谱库的构建方法及其应用。本发明经过反复多次不懈的试验成功地筛选到能有效鉴别结缕草不同种质的选择性扩增引物及引物组合，高质量的DNA指纹图谱，不但具有扩增位点多、带型质量好、分辨率高、条带疏密合适及分布均匀，易精准地检测出样本的细微差异，从而为构建结缕草AFLP分子指纹图谱库奠定了技术基础；还通过提供的试剂方法8对引物组合等成功而有效的鉴别出90个不同种质结缕草，为今后结缕草种质鉴别、新品种登记、注册和产权保护等提供了科学依据。

技术领域

本发明属于植物分子育种领域，涉及一种结缕草AFLP分子指纹图谱库的构建方法及其应用，尤其涉及到为形态上不便于鉴别的结缕草提供一种能通过分子指纹图谱库中的遗传标记进行种质鉴别或品种鉴定及品种权保护等方面的鉴定技术。

背景技术

结缕草以其极高的耐践踏性、对紧实土壤的强适应性及高弹性、强抗旱耐瘠薄性和耐盐碱性及适宜低养护粗放性管理等特性而成为高质量足球场及运动场草坪的首选，也是保持优良生态绿地、固土护坡及水土保持的草坪地被；是世界公认的优良草坪草。

结缕草属(Zoysia genus)植物生长的生态环境复杂多样，种间杂交及天然杂种大量存在，种内变异也很大，这些都使得结缕草天然野生种群个体间保持了丰富的自然变异、基因型差异及遗传多样性。我国结缕草种质资源位居世界首位，也是世界上唯一生产野生结缕草种子并具有出口创汇能力的国家。结缕草优良的特性，使得美国、日本等发达国家率先进行了新品种的常规选培育，但目前结缕草在生产上的使用大多还是以野生资源为主，育成品种(除兰引3号外)的广泛普遍应用还较少见到。鉴于结缕草良好地经济效益，友好地环境适应性，广阔的开发利用前景及目前的使用状况，亟待加强对结缕草种质的鉴别筛选，品种鉴定及品种权的保护等。

生物在长期进化过程中或理化诱变剂下所产生的可遗传变异，都是由于DNA碱基序列变异所致。同一物种内存在的极为丰富的DNA碱基序列变异，为开发和利用DNA分子标记作为遗传鉴定奠定了坚实的基础。一般狭义地分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列标记，是DNA水平上遗传多态性的直接反映。目前，以DNA水平为基础的分子标记技术包括PCR技术、RFLP技术、RAPD技术、AFLP技术、SSR和ISSR技术、多位点小卫星DNA指纹技术和微卫星标记技术、基因芯片技术以及SNP技术等。

AFLP是一种基于RFLP和PCR基础上的遗传标记指纹图谱技术，它与上述其它方法相比，具有高度个体特异性和稳定可靠性，且以快速、灵敏、检测效率高、遗传多态性丰富等特点，大大提高了遗传分析的效率，是可以为任何来源的种质提供有力的DNA指纹，评估遗传多样性，有效地确定亲本之间的遗传差异和亲缘关系的一种十分先进的分子标记；AFLP以其检测的位点数多，保证了鉴定的高度准确性，因而被公认为是植物种质建立指纹图谱效率最高的理想标记。其技术既可以用于检测品种的质量和纯度，也可运用于稀有珍贵植物资源和名、特、优品种的鉴定、引种以及濒危植物的考察和保护工作。其高质量指纹图谱、稳定可靠的分析结果不但有利于更好地利用大量丰富的育种种质资源，更可作为新品种登记、注册和产权保护的重要依据。

但到目前为止，国内外尚未发现应用AFLP分子标记技术对结缕草种质进行分子检测、鉴别等方面的报道，更未发现利用优选出的8对AFLP引物组合构建结缕草分子标记指纹图谱库及种质鉴别的报道。

发明内容