[发明专利]结缕草AFLP分子指纹图谱库的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种引物对组合，其特征在于，所述引物对组合包括8组引物对，具体包括引物E-AAG和引物M-CAG、引物E-AAG和引物M-CTA、引物E-AAG和引物M-CTG、引物E-ACG和引物M-CAG、引物E-AGC和引物M-CAC、引物E-AGG和引物M-CAC、引物E-AGG和引物M-CAG、引物E-AGG和引物M-CTA，所述引物E-AAG序列如SEQ ID NO：1所示，所述引物M-CAG序列如SEQ ID NO：2所示；所述引物M-CTA序列如SEQ ID NO：3所示，所述引物M-CTG序列如SEQ ID NO：4所示，所述引物E-ACG序列如SEQ ID NO：5所示，所述引物E-AGC序列如SEQ ID NO：6所示，所述引物M-CAC序列如SEQ ID NO：7所示，所述引物E-AGG序列如SEQ ID NO：8所示。

2.权利要求1所述的引物对组合在结缕草种质鉴别或品种鉴定或AFLP分子指纹图谱库的构建中的应用。

3.一种结缕草AFLP分子指纹图谱库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）结缕草不同种质获得：收集国内外不同生境种子或种质；

2）结缕草基因组DNA的提取：在生长季采集不同种质结缕草的新鲜幼嫩叶片分别装袋带回实验室，采用CTAB法提取DNA；

3）结缕草AFLP反应体系的建立与优化：将提取的不同种质结缕草基因组DNA，经过酶切、连接、预扩增、选择扩增、电泳步骤，得到各个种质的相应条带或指纹图谱，其中具有相同条带的被认为是拥有同样的遗传位点，具有不同大小的条带被认为拥有不同的遗传位点，由此获得结缕草AFLP分子指纹图谱标记；

4）结缕草AFLP指纹图谱库及分析：通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染后上测序仪扫描获得AFLP凝胶电泳分离图谱库，通过软件分析获得结果，按照相同迁移位点有扩增带记为1，无带为0的方法记录电泳谱带，并转化为“0、1”原始数据矩阵，进行遗传变异信息统计分析及亲缘关系多态性图谱分析，从而筛选出权利要求1所述的引物对组合从而构建结缕草AFLP分子指纹图谱库。

4.根据权利要求3所述的结缕草AFLP分子指纹图谱库的构建方法，其特征在于，所述步骤1）结缕草品种包括国内外结缕草品种及或国内不同地区野生种质资源及通过理化诱变剂诱导体细胞基因突变，以体胚再生获得突变体结缕草。

5.根据权利要求3所述的结缕草AFLP分子指纹图谱库的构建方法，其特征在于，所述步骤2）CTAB法为改良CTAB法。

6.根据权利要求3所述的结缕草AFLP分子指纹图谱库的构建方法，其特征在于，所述步骤3）预扩增引物序列为：EcoR I预扩引物序列：5’- GAC TGC GTA CCA ATT CA- 3’，Mse I预扩引物序列：5’ -GAT GAG TCC TGA GTA AC-3’；预扩增反应条件为：预变性 94℃ 2min；变性94℃ 30S；复性56℃ 30S；延伸 72℃ 80S；从2到4循环30轮；延伸加时 72℃ 5min，于4℃保存备用。

7.根据权利要求3所述的结缕草AFLP分子指纹图谱库的构建方法，其特征在于，所述步骤4）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法为：将步骤3）得到的选择性扩增产物和甲酰胺上样液混合，95℃变性5-8min后立即置于冰浴中；制备6%聚丙烯酞胺凝胶，凝胶厚度为0.4mm；恒功率50-60W预电泳约30min后，取5-7μl变性液作为上样液加到凝胶中电泳，恒功率40-50W，电泳至溴酚兰接近胶底后，停止电泳。