[发明专利]一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法

权利要求书

1.一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)通过高通量测序筛选到在雌雄ESCs和PGCs中差异表达的基因JUN，qRT-PCR检测JUN在两性鸡胚发育过程中的表达差异；

(2)构建慢病毒JUN-shRNA干扰和JUN-OE过表达载体，进行体内血管注射；

(3)通过qRT-PCR，ELISA和石蜡切片检测性别决定相关基因，性激素和性腺的变化，验证JUN对鸡胚雌性分化过程中的作用。

2.根据权利要求1所述的一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，其特征是，步骤(1)中，首先从RNA-seq数据中筛选得到在两性ESCs和PGCs中差异表达的关键基因JUN，通过qRT-PCR检测JUN在0-18.5d的鸡胚发育过程中的表达变化趋势，Real-time PCR反应总体积20μL，含2μL模板，10μL 2×SuperReal Color PreMix，0.6μL上下游引物，6.8μLH₂O；在PCR仪上进行反应，结果采用biarad实时PCR检测系统进行分析。

3.根据权利要求2所述的一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，其特征是，所述在PCR仪上进行反应时，条件为：

95℃预变性15mins；95℃10s、55℃30s、72℃32s，共40个循环；循环结果采用biarad实时PCR检测系统进行分析。

4.根据权利要求2所述的一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，其特征是，步骤(2)中，将pCDH CMV-MCS-EF1-TagRFP+Puro载体和JUN的CDS区模板分别进行XbaI和NotI位点的双酶切，回收片段后通过T4连接酶连接构建得到OE-JUN载体；根据JUN的CDS区设计三个干扰靶点，插入gatcc-TTCAAGAGA-TTTTTTg序列合成上下游反向互补的oligo片段，退火连接后与pGMLV-SC5质粒连接，形成重组干扰载体sh-JUN；分别将构建成功的OE-JUN和sh-JUN载体转化感受态细胞挑取阳性菌落送测验证；测序成功的载体转染到培养至70％汇合度的DF1细胞内，48h之后收取细胞qRT-PCR检测JUN表达，选取活性最强的载体交由慢病毒包裹后，在2.5d鸡胚体内血管注射。

5.根据权利要求4所述的一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，其特征是，步骤(3)中，通过石蜡切片对18.5d鸡胚性腺的皮髓质的特征进行比较；将4.5d的鸡胚和18.5d分离的性腺保存于4％多聚甲醛内，固定24h后转入70％-100％酒精中逐级脱水；放入二甲苯中待透明后浸蜡1h再进行包埋、切片、烫片、展片、脱蜡复水；切片先在苏木素染液中浸泡2min30s，自来水下冲洗10min，再在伊红染色浸泡3-5min后自来水冲洗5min，脱水封片，于正置显微镜下观察切片。

6.根据权利要求5所述的一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，其特征是，步骤(3)中，qRT-PCR检测5.5d和18.5d阶段的鸡胚性腺的雌雄标记基因(DMRT1、SOX9、FOXL2、和ESR1)的表达变化；

ELISA检测鸡胚性腺中4.5d-18.5d间每隔两天的雌二醇变化；取鸡胚性腺称重后加入PBS进行细胞破碎，离心取上清通过ELISA试剂盒孵育显色，在酶标仪450nm波长下检测吸光度值，根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，分析各组的雌二醇含量；

根据性别决定基因，性腺形态学和性激素上的变化筛选和验证得到雌性性别分化基因JUN。