[发明专利]一种用于宫颈癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法

权利要求书

1.一种用于宫颈癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒，所述试剂盒包括检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平的特异性引物和探针，所述特定基因包括EPB41L3和ACTB。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于检测EPB41L3基因甲基化状态的特异性引物和探针选自下述三种特异性引物和探针组合中的任一种：特异性引物SEQ ID NO:1-2和探针SEQ ID NO:3、特异性引物SEQ ID NO:4-5和探针SEQ ID NO:6、特异性引物SEQID NO:7-8和探针SEQ ID NO:9。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，用于检测ACTB基因甲基化状态的特异性引物和探针为特异性引物SEQ ID NO:10-11和探针SEQ ID NO:12。

4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11均经过硫代磷酸酯修饰，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交；

和/或，所述探针SEQ ID NO:3、6、9、12是基于TaqManTM设计的，且在严格条件下与甲基化或非甲基化的目标基因区域杂交。

5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，EPB41L3基因探针SEQ ID NO:3、6、9核苷酸序列5’端标记FAM，3’端标记QSY；ACTB基因探针SEQ ID NO:12核苷酸序列5’端标记VIC，3’端标记MGBNFQ；

和/或，所述特异性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11和所述探针SEQ ID NO:3、6、9、12的长度为10-50nt；

和/或，所述试剂盒中还包含下述组成部分：dNTP混合溶液、MgCl2溶液、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、PCR去离子水；

和/或，所述试剂盒中还包含下述组成部分：组织基因组DNA提取试剂和DNA甲基化转化试剂，优选地，所述宫颈细胞DNA甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐；

和/或，所述受试样品DNA为完整基因组、无细胞DNA或循环肿瘤DNA。

6.一种根据权利要求1-5任一所述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)宫颈细胞中的DNA提取：利用组织DNA提取试剂从待测样本中提取宫颈细胞中的DNA；

(2)DNA甲基化转化：利用DNA甲基化转化试剂对提取的宫颈细胞中的DNA进行亚硫酸氢盐处理并随后进行纯化；

(3)将进行甲基化转化并纯化的血浆游离DNA进行荧光定量PCR扩增，PCR反应结束后，将Ct阈值设定在线性扩增区间，Ct值小于40的扩增认定为阳性；

(4)结果判定：当内部参照位点ACTB检测结果阳性，靶点EPB41L3的三个重复扩增中至少两个为阳性则确定为该靶点结果阳性；

优选地，所述第(3)步骤中，每个模板的PCR扩增做三个重复；

优选地，所述第(3)步骤中，选用下述方法中的任一种：甲基化特异性定量PCR、实时甲基化特异性PCR、使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR；

和/或，每个反应体系10μL，其中含(0.5-1.5μL)1xPCR反应缓冲液、200-400μm dNTPs、3-6mM MgCl2、1-3U AmpliTaq Gold DNA聚合酶、30-60nM ROX染料。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，EPB41L3基因区域靶点的引物各300-500nM；

和/或，EPB41L3基因区域靶点的探针各200-300nM。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，ACTB基因区域靶点的引物150-250nM，ACTB基因区域靶点的探针50-150nM。