[发明专利]基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法及其细菌检测的应用

说明书

本发明公开了基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法及其细菌检测的应用，比色法包括制备Y形结构结合切刻内切酶信号放大传感体系，具体为：1）将DNA1与DNA2溶于反应缓冲体系中在85~95℃条件下加热5~10分钟，自然冷却到室温；2）经步骤1）后，在其所得体系继续加入3个茎环结构、比色信号探针SP，85~95℃条件下加热5~10分钟，自然冷却到室温；3）经步骤2）后，在其所得体系中加入切刻内切酶Nt.BbvCI在25~65℃条件下孵育30~60分钟，在步骤3）所得体系内加入氯化血红素、2,2'‑联氮‑双‑3‑乙基苯并噻唑啉‑6‑磺酸，混匀后室温放置10~40分钟，再加入H₂O₂，混匀后立即观察颜色变化；具有灵敏度高、成本低和结果可视化等优点，将在食品安全和环境监测领域具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及比色传感技术领域，具体的说，基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法及其细菌检测的应用。

背景技术

沙门氏菌是一种最重要的人畜共患病原菌，极其危害人类健康和畜牧养殖业的发展。而鼠伤寒沙门氏菌是目前已知的2500多种血清型中最为常见的一种，感染发病率居所有沙门氏菌之首。鼠伤寒沙门氏菌普遍的存在于蛋肉类产品及乳制品。即使极低浓度的鼠伤寒沙门氏菌依然可以引起人类的各种临床疾病，例如急性肠胃炎、败血症、以及败血症引发的各种内脏损伤等，有的病甚至可能致死。

目前鼠伤寒沙门氏菌的传统检测方法主要包括基于培养、聚合酶链式反应及其酶联免疫吸附的方法，这些方法普遍存在耗时耗力、操作繁琐、成本高、需要专业的仪器设备和操作人员的问题。随着人们对食品安全问题关注度的不断增长，传统方法已经不能满足人们的检测需要，急需发展一种操作简单、低成本和高灵敏集成的方法。比色传感器是光学传感器的一种，其信号的产生是通过裸眼可见的颜色变化实现的，因此无需专业的分析设备和操作人员监测信号，从而成为最具潜力发展成为“床旁检测”的一种方法。然而目前已报道的比色法对于鼠伤寒沙门氏菌检测普遍面临灵敏度低、不能直接检测菌体、涉及DNA提取或抗体固定等预处理和繁琐的步骤、需昂贵的特异性标记等问题，应用前景并不乐观。因此，制备一种集高灵敏度、低成本和操作简单于一体的比色法检测鼠伤寒沙门氏菌在食品安全和环境卫生等领域具有重要的实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法及其细菌检测的应用，具有灵敏度高、成本低和结果可视化等优点，将在食品安全和环境监测领域具有良好的应用前景。

本发明通过下述技术方案实现：基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，该比色法通过Y形结构结合切刻内切酶信号放大传感体系和G-四链体/氯化血红素DNAzyme比色检测体系实现，其中，传感体系包括针对目标细菌的DNA1和DNA2、组装形成Y形结构的3个茎环结构(HPA、HPB、HPC)、比色信号探针SP、切刻内切酶Nt.BbvCI以及反应缓冲体系；所述DNA1和DNA2、3个茎环结构以及比色信号探针SP序列如序列表所示。

其中，DNA1具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；DNA2具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；茎环结构HPA具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；茎环结构HPB具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；茎环结构HPC具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；比色信号探针SP具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

所述比色检测体系包括氯化血红素、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、H₂O₂。

在具体实现时，该比色法包括制备Y形结构结合切刻内切酶信号放大传感体系，所述制备Y形结构结合切刻内切酶信号放大传感体系的具体方法为：

1)将DNA1与DNA2按照摩尔比为1:2～6溶于反应缓冲体系中在85～95℃条件下加热5～10分钟，自然冷却到室温；