[发明专利]基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法及其细菌检测的应用

权利要求书

1.基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，包括制备Y形结构结合切刻内切酶信号放大传感体系，其特征在于：所述制备Y形结构结合切刻内切酶信号放大传感体系的具体方法为：

1)将DNA1与DNA2溶于反应缓冲体系中在85～95℃条件下加热5～10分钟，自然冷却到室温；

2)经步骤1)后，在其所得体系继续加入茎环结构HPA、茎环结构HPB、茎环结构HPC、比色信号探针SP后85～95℃条件下加热5～10分钟，自然冷却到室温；

3)经步骤2)后，在其所得体系中加入切刻内切酶Nt.BbvCI在25～65℃条件下孵育30～60分钟。

2.如权利要求1所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，其特征在于：还包括制备G-四链体/氯化血红素DNAzyme比色检测体系：在所述步骤3)所得体系内加入氯化血红素、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，混匀后室温放置10～40分钟，再加入H₂O₂，混匀后立即观察颜色变化。

3.如权利要求2所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，其特征在于：所述的氯化血红素的浓度为0.2～1.6μM，所述的2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的浓度为0.5～3.5mM，所述的H₂O₂的浓度为2～6mM。

4.根据权利要求1或2或3所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，其特征在于：所述DNA1与DNA2摩尔比为1:2～6；所述的3个茎环结构的浓度为50～200nM；所述比色信号探针SP浓度为100～500nM；所述切刻内切酶Nt.BbvCI浓度为1～10U mL^-1。

5.根据权利要求1或2或3所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法，其特征在于：所述反应缓冲体系包括20～60mM醋酸钾、5～30mM Tris-醋酸、5～20mM醋酸镁，且反应缓冲体系pH 7～9。

6.采用如权利要求1～5任一项所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法进行鼠伤寒沙门氏菌检测的应用，其特征在于：包括下述步骤：

(1)将DNA1与DNA2按照摩尔比为1:2～6加入反应缓冲体系中在85～95℃条件下加热5～10分钟，自然冷却到室温；然后加入不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌，混合均匀，在30～～40℃条件下孵育30～120分钟；然后加入50～200nM的茎环结构HPA、茎环结构HPB、茎环结构HPC与100～500nM的比色信号探针SP在85～95℃条件下加热5～10分钟，自然冷却到室温；然后加入1～10U mL^-1的切刻内切酶Nt.BbvCI在25～65℃条件下孵育30～60分钟；

(2)取步骤(1)所得体系加入0.2～1.6μM氯化血红素和0.5～3.5mM2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，混匀后室温放置10～40分钟；

(3)向步骤(2)所得的反应体系中加入2～6mM H₂O₂，混匀后，立即观察溶液颜色变化。

7.如权利要求1～5任一项所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法在鼠伤寒沙门氏菌检测的抗干扰性能中的应用。

8.如权利要求1～5任一项所述的基于Y形结构自组装和切刻内切酶结合的比色法在牛奶样品和猪肉样品分析中的应用。